Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

Поиск последовательностей 16S рРНК выбранных бактерий:

Бактерия	AC записи EMBL с последовательностью генома	координаты 16S рРНК в этой записи	На прямой или комплементарной цепи оказалась последовательность этой рРНК
Bacillus anthracis	AE016879	9335..10841	Прямая цепь
Bacillus subtilis	AL009126	9810..11364	Прямая цепь
Clostridium botulinum	CP000726	9282..10783	Прямая цепь
Clostridium tetani	AE015927	41801..43309	Обратная цепь
Staphylococcus aureus	AP009324	531922..533476	Прямая цепь
Staphylococcus epidermidis	AE015929	1598006..1599559	Обратная цепь
Streptococcus pyogenes	AE004092	17170..18504	Прямая цепь
Streptococcus pneumoniae	AE005672	15450..16784	Прямая цепь

P.S. В записи, содержащей геном последней бактерии, ген 16 S рРНК отсутствовал, поэтому его пришлось искать, используя blastn на сайте NCBI. В качестве выравниваемых последовательностей были взяты последовательность гена 16 S рРНК наиболее родственной бактерии (Streptococcus pyogenes) и полный геном Streptococcus pneumoniae, штамм TIGR4 из банк EMBL (запись AE005672). В результате было найдено 4 хорошо выравнивающихся участка, первый из которых был принят за ген 16 S рРНК.

Вырежем найденные последовательности с помощью команды "seqret -sask embl:<номер записи>", указывая координаты и цепь(прямую или обратную). Полученные последовательности объединим в файл 16s.fasta, исправив названия последовательностей на "<идентификатор организма>, 16 S rRNA".
Выровняем последовательности программой muscle (команда "muscle -in 16s.fasta -out 16s_aligned.fasta").
Полученный файл 16s_aligned.fasta импортируем в программу Mega, выбрав "Nucleotide Sequences" и далее выбрав "Последовательности, не кодирующие белки".
С помощью меню "Phylogeny" построим дерево методом "Neighbour-Joining". Полученное дерево:
Полученное дерево совпадает с правильным деревом, отражающим филогению бактерий. Однако, при использования метода "Neighbour-Joining" для белков не удавалось получить верного дерева (видимо, матрица расстояний для белков (BLOSUM62) не слишком удачна для построения деревьев в данном случае).

Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Воспользуемся blastp командой "blastp -query clpx_bacsu.fasta -subject proteo.fasta -evalue 0.001 -outfmt 6 -out clpx_homologs.out". Файл с результатами: clpx_homologs.out
1. В случае Clostridium botulinum нашлось 2 достоверных гомолога:
  - CLPX_CLOB1;
  - RUVB_CLOB1.
2. В случае Clostridium tetani нашлось 4 достоверных гомолога:
  - CLPB_CLOTE;
  - CLPX_CLOTE;
  - ECFA1_CLOTE;
  - RUVB_CLOTE.
3. В случае Streptococcus pyogenes нашлось 3 достоверных гомолога:
  - CLPX_STRP1;
  - PSTB2_STRP1;
  - RUVB_STRP1.
4. В случае Streptococcus pneumoniae нашлось 7 достоверных гомологов:
  - ACKA_STRPN;
  - CLPE_STRPN;
  - CLPX_STRPN;
  - FTSH_STRPN;
  - PTSB1_STRPN;
  - PTSB2_STRPN;
  - RUVB_STRPN.
5. В случае Bacillus anthracis нашлось 4 достоверных гомолога:
  - CLPB_BACAN;
  - CLPX_BACAN;
  - HSLU_BACAN;
  - RUVB_BACAN.
6. В случае Bacillus subtilis нашлось 14 достоверных гомологов:
  - CLPC_BACSU;
  - CLPE_BACSU;
  - CLPX_BACSU;
  - CLPY_BACSU;
  - FHUC_BACSU;
  - FTSH_BACSU;
  - RUVB_BACSU;
  - SUNT_BACSU;
  - XKDC_BACSU;
  - YFIC_BACSU;
  - YHCG_BACSU;
  - YJOB_BACSU;
  - YOJN_BACSU;
  - YXLF_BACSU.
7. В случае Staphylococcus aureus нашлось 3 достоверных гомолога:
  - CLPX_STAA1;
  - HSLU_STAA1;
  - RUVB_STAA1.
8. В случае Staphylococcus epidermidis нашлось 5 достоверных гомологов:
  - CLPB_STAES;
  - CLPC_STAES;
  - CLPX_STAES;
  - HSLU_STAES;
  - Y1092_STAES.
Вырежем полученные последовательности в отдельный файл 42.fasta
Выровняем полученные последовательности программой muscle (команда "muscle -in 42.fasta -out 42_out.fasta").
Импортируем полученный файл 42_out.fasta в программу Mega и построим дерево методом Neighbour-Joining. Полученное дерево:
На полученном дереве имеется множество пар ортологов и несколько пар паралогов.
- Ортологи:
  1. PSTB2_STRP1 и PSTB2_STRPN;
  2. CLPC_BACSU и CLPC_STAES;
  3. CLPB_CLOTE и CLPB_BACAN;
  4. RUVB_BACSU и RUVB_BACAN.
- Паралоги:
  1. YFIC_BACSU и YJOB_BACSU;
  2. FHUC_BACSU и YHCG_BACSU.