Чтение последовательносей по Сэнгеру

Меню

На главную

Третий семестр

Для выполнения этого практикума мне достались файлы с прямой и обратной последовательностями, полученными с помощью капиллярного секвенатора.
Программа Chromas отображает хроматограммы. Открыв в ней прямую и комплементарную обратной последовательности, я заметила, что в начале и конце последовательностей есть небольшие участки, где не удается прочитать хроматограмму. В этих участках длина последовательности соразмерна с длиной праймеров, и поэтому на хроматограмме много разных сигналов одновременно. В таблице приведена информация о длине этих нечитаемых концов.
Прямая Комплиментарная обратной
Начало 1-19 -33-(-23)
Конец 705-718 656-686

Рис. 1, 2, 3, 4, 5. 1 - хорошо читаемый фрагмент, 2 - плохо читаемый фрагмент в начале, 3 - на верхней хроматограмме на 31 позиции два гуанина вместо одного, 4 - высокий уровень шума на 63 позиции на верхней хроматограмме, на нижней четкий сигнал гуанина, 5 - на 42 позиции на верхней хроматограмме сигнал и гуанина, и аденина, на нижней только аденин.


Остальная хроматограмма вполне читаемая. В среднем шум в 4 раза ниже, чем сигнал. Но при этом средняя длина шума и сигнала может различаться в разных точках оси Х. Так же высота очевидных сигналов неодинаковая. Большинство пиков примерно равны, но есть несколько зеленых(А) и черных пиков(G), которые превышают среднюю высоту в 1,5-2 раза. На комплементарной обратной наоборот более высокие синие(C) и красные(Т) пики. Если подряд идет несколько одинаковых нуклеотидов, то их пики разделяются только наполовину, а иногда и еще меньше.
В файле Jalview представлено выравнивание прямой и комплементарной обратной последовательностей. В начале и конце большие участки последовательностей не выравнялись. Так же на позициях 21 и 27 (для прямой последовательности) стояли лишние гуанины. Возможно, это произошло как раз, потому что пики одинаковых нуклеотидов не всегда четко расходятся или создают много шума рядом.
Чистая последовательность доступна по ссылке. Буквы N заменены на маленькие буквы нуклеотидов, соответствующие этой позиции на хроматограмме (Позиции 242, 327, 345, 348, 357, 367, 405, 432, 452, 519, 616). Эти маленькие буквы совпали с теми, что были определены автоматически на одной из последовательностей. Это значит, что хроматограммы прямой и комплементараной обратной последовательностей дают четкий результат, дополняя друг друга. На прямой последовательности

Нечитаемая хроматограмма

Рис.6. Потекшая краска на хроматограммме.

Так как каждый пик соответсвует определенной длине последовательности, то ширина его не должна быть больше, чем один нуклеотид. На приведенной хроматограмме пик занимает 3 нуклеотида. Это признак того, что хроматография сделана неправильно - появилось пятно краски.

© Корзина Анастасия, 2015