Трансмембранные белки

1. База данных OPM

В качестве примера белка, содержащего в трансмембраннной части α-спираль был выбран рецептор жирных кислот (Free fatty acid receptor 1, 1.1.01.02., PDB ID: 4PHU). На рисунке 1 представлено изображение этого белка. В таблице 1 представлена характеристика данного белка.

Рисунок 1. Изображение белка 1.1.01.02. [1]. Красным показана внешняя p-мембрана, синим - внутренняя n-мембрана

*Таблица 1. Характеристика белка 1.1.01.02.*
Толщина гидрофобной части белка в мембране	31.8 ± 1.2 A
Координаты трансмембранных спиралей	1( 5- 28), 2( 43- 67), 3( 76- 102), 4( 123- 144), 5( 179- 204), 6(2223-2249), 7(2257-2276)
Среднее количество остатков в одной трансмембранной спирали	24
Локализация	Трансмембранный

В качестве примера белка, содержащего в трансмембраннной части β-спираль был выбран LPS-собирающий белок (LPS-assembly protein complex, 1.3.28.01., PDB ID: 5IV9). На рисунке 2 представлено изображение этого белка. В таблице 2 представлена характеристика данного белка.

Рисунок 2. Изображение белка 1.3.28.01. [2]. Красным показана внешняя p-мембрана, синим - внутренняя n-мембрана

*Таблица 2. Характеристика белка 1.3.28.01.*
Толщина гидрофобной части белка в мембране	23.4 ± 1.0 A
Координаты трансмембранных спиралей	1( 205- 210), 2( 218- 225), 3( 233- 238), 4( 246- 254), 5( 261- 268), 6( 287- 296), 7( 303- 310), 8( 332- 340), 9( 344- 353), 10( 366- 376), 11( 382- 391), 12( 405- 416), 13( 423- 432), 14( 458- 467), 15( 481- 490), 16( 528- 538), 17( 548- 557), 18( 580- 587), 19( 593- 600), 20( 610- 618), 21( 624- 631), 22( 655- 664), 23( 671- 676), 24( 685- 693), 25( 700- 707), 26( 724- 731)
Среднее количество остатков в одной трансмембранной спирали	9
Локализация	Трансмембранный (внешняя мембрана грамтотрицательных бактерий)

2. Анализ предсказания трансмембранных спиралей

Далее был проведен сравнительный анализ точности предсказания трансмембранных спиралей у известного белка 4PHU, используемого в первом задании. Для сравнения использовались сервисы TMHMM и Phobius. На вход оба сервиса запрашивают аминокислотную последовательность белка. Текстовый и графический результаты работы программ представлены ниже.
TMHMM

 # 4phu:A Length: 434
# 4phu:A Number of predicted TMHs:  7
# 4phu:A Exp number of AAs in TMHs: 144.01047
# 4phu:A Exp number, first 60 AAs:  36.66187
# 4phu:A Total prob of N-in:        0.17113
# 4phu:A POSSIBLE N-term signal sequence
4phu:A	TMHMM2.0	outside	     1     4
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	     5    27
4phu:A	TMHMM2.0	inside	    28    39
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	    40    59
4phu:A	TMHMM2.0	outside	    60    78
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	    79   101
4phu:A	TMHMM2.0	inside	   102   113
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	   114   136
4phu:A	TMHMM2.0	outside	   137   179
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	   180   202
4phu:A	TMHMM2.0	inside	   203   376
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	   377   399
4phu:A	TMHMM2.0	outside	   400   413
4phu:A	TMHMM2.0	TMhelix	   414   433
4phu:A	TMHMM2.0	inside	   434   434

Первая строчка содержит информацию о длине аминокислотной последовательности белка, вторая - число предсказанных трансмембранных альфа-спиралей, третья - ожидаемое число аминокислотных остатков, входящих в состав трансмембранных альфа-спиралей (если это число больше 18, то белок скорее всего действительно является трансмембранным), четвертая - ожидаемое число аминокислотных остатков, входящих в состав трансмембранных альфа-спиралей, из первых 60 аминокислот (если это число довольно большое, то стоит проверить то, что предсказанная N-концевая трансмембранная спираль не является сигнальным пептидом). Пятая строчка содержит инфрмацию об общей вероятности того, что N-конец белка расположен на цитоплазматичечкой стороне мембраны. Шестая строчка появляется тогда, когда Exp number, first 60 AAs слишком большое. Затем идет информация о наиболее вероятной локализации участков белка (расположен ли он с внешней, внутренней стороны мембраны или находится внутри нее).

Рисунок 3. Результат работы программы TMHMM. По оси Y отложена постериорная вероятность локализации участка белка (красным - трансмембранная, синим - цитоплазматическая, розовым - внешнаяя). По оси X расположены аминокислотные остатки. Сверху над графиком расположено лучшее предсказание. График получается в результате вычисления общей вероятности остатку быть в спирали, с наружней или внутренней стороны относительно мембраны, суммированной по всем возможным путям, содержащихся в модели. Иногда может казаться, что график и референсное предсказание противоречат друг другу (как, например, на этом рисунке участок на границе между перым розовым и красным участками (по графику остатки должны быть покрашены розовым в референсе (вероятность этого выше), а они отнесены к трансмембранному участку и покрашены красным. Это случается из-за того, что график показывается вероятности для каждого остатка, а референсное предсказание - наиболее вероятная (в целом) структура.

Phobius

 
ID   4phu:A
FT   TOPO_DOM      1     11       NON CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM     12     30       
FT   TOPO_DOM     31     41       CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM     42     61       
FT   TOPO_DOM     62     80       NON CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM     81    102       
FT   TOPO_DOM    103    113       CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM    114    136       
FT   TOPO_DOM    137    175       NON CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM    176    202       
FT   TOPO_DOM    203    375       CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM    376    394       
FT   TOPO_DOM    395    413       NON CYTOPLASMIC.
FT   TRANSMEM    414    433       
FT   TOPO_DOM    434    434       CYTOPLASMIC.
//

Результат программы представляет собой разметку белка по аминокислотным остаткам и предсказание локализации размеченных участков.

Рисунок 4. Результат работы программы Phobius. По оси Y отложена постериорная вероятность локализации участка белка (со стороны цитоплазмы (зеленым), с внешней стороны (синим), внутри мембраны (серым) или сигнальный пептид (красным). По оси X расположены аминокислотные остатки. Снизу графика расположено предсказание структуры в общем.

В таблице 3 приведено сравнение результатов работы двух алгоритмов. В качестве референсной была взята информация о реальных структурных данных (однако две последние спирали в ней явно аннотированы неправильно). Можно заметить, что оба алгоритма правильно предсказали все 7 спиралей и из информации, полученной из Phobius, можно сделать вывод о том, что N-концевая последовательность не является сигнальным пептидом (несмотря на предупреждение, выданное TMHMM). Для каждой спирали выбирался алгоритм, который предсказал ее лучше (бОльшее совпадение координат спирали). Получилось, что правильнее структуру белка 4phu предсказал сервис TMHMM.

*Таблица 3. Характеристика белка 1.1.01.02.*
Номер спирали	Структура	TMHMM	Phobius	Лучшее предсказание
1	5- 28	5- 27	12- 30	TMHMM
2	43- 67	40- 59	42- 61	Phobius
3	76- 102	79- 101	81- 102	TMHMM
4	123- 144	114- 136	114- 136	-
5	179- 204	180- 202	176- 202	TMHMM
6	2223-2249	377- 399	376- 394	?
7	2257-2276	414- 433	414- 433	?

Оба алгоритма включают в себя построение скрытых марковских моделей, разница состоит в том, что Phobius комбинирует алгоритм предсказания топологии трансмембранного белка (TMHMM) и предсказания сигнального белка. Путем проработки предсказания изначально выбирать одну из двух подмоделей, Phobius позволяет лучше различать, является ли начальный участок белка сигнальным пептидом или трансмембранным регионом (меньше ложноположительных результатов для трансмембранных спиралей) [3]. На рисунке 5 представлена модель алгоритма Phobius (разделенного на две подмодели для участков белка, расположенных с наружней стороны мембраны).

Рисунок 5. Алгоритм работы программы Phobius [4]

3. База данных TCDB

1. Белок 4phu относится к семейству, имееющему идентификатор в базе TCDB 9.A.14, который соответствует рецепторам, сопряженным с G-белками. Первая цифра идентификатора соответсвует классу транспортера (9 в данном случае означает недостаточно охарактеризованное семейство), второй символ - это буква, обозначающая принадлежность к подклассу транспортера, определяется тем, какой ресурс энергии используется транспортером для работы. Буква А в конкретном случае означает то, что биохимический механизм транспорта неизвестен. Все транспортеры с невыявленным механизмом транспорта относятся к этому подклассу и переносятся в другие после выяснения механихмов их работы. Следующий номер соответствует семейству (суперсемейству) транспортеров. В случае белка 4phu это семейство рецепторов, сопряженных с G-белками. Если белок хорошо охарактеризован, то его TCDB идентификатор содержит еще 2 цифры, обозначающие подсемейство и транспортируемый субстрат.
Этот рецептор наиболее вероятно активируется эйкоза-3-еновой кислотой (C20:3) и обеспечивает стимуляцию инсулиновой секреции. Семейство этих рецепторов рассматривается как важный компонент, обоспечивающий регуляцию метаболизма организма (в частности, рецеция и анализ поступающей пищи), поэтому они могут быть потенциальной мишенью для лечения метаболических расстройтв, таких как диабет второго типа и ожирение [5]. В базах GO и KEGG не удалось найти этого белка.
2. Белок 5IV9 относится к семейству, имееющему идентификатор в базе TCDB 1.B.42., который соответствует семейству, обеспечивающих сборку ЛПС (липополисахарид) на внешней стороне мембраны грамотрицательных бактерий. Структуные части ЛПС синтезируются по-отдельности на внутренней мембране, затем транспортируются наружу и собираются в большой полимер. Цифра 1 означает, что белок принадлежит к супер семейству каналов/пор. Буква B - то, что трансмембранный участок представлен бета-бочонком. Цифра 42 - отнесение к конкретному семейству.

4. Источники

[1] http://opm.phar.umich.edu/protein.php?pdbid=4phu
[2] http://opm.phar.umich.edu/protein.php?pdbid=5iv9
[3] ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/resources/theses/dogruel/chapter5.pdf
[4] Käll L, Krogh A, Sonnhammer ELL. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction—the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 2007;35(Web Server issue):W429-W432. doi:10.1093/nar/gkm256.
[5] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?ascbin=8&maxaln=10&seltype=2&uid=cd15169