Балакина Миниобзор

1 Введение

Klebsiella quasipneumoniae — патогенный грамотрицательный организм, способный вызывать серьезные инфекции у людей и приобретать значительную устойчивость к антибиотикам [2]. Спектр инфекций широк, включая инфекции мочевыводящих путей и инфекции дыхательных путей [2]. Штаммы этой бактерии могут быть также вирулентны, как и штаммы известной бактерии Klebsiella quasipneumoniae [5]. Klebsiella quasipneumoniae выделили в новый вид недавно, до полногеномного секвенирования K. pneumoniae, Klebsiella variicola и Klebsiella quasipneumoniae объединяли в один вид, в результате чего истинная распространенность данной бактерии недооценена [2,6]. Klebsiella quasipneumoniae при помощи горизонтального переноса генов активно передает карбапенемазы, что вызывает распространение резистентности к антибиотикам бета-лактамного типа [8]. Карбапенемы – надежные, безопасные и высокоэффективные бета-лактамы, поэтому резистентность к ним — важная проблема человечества [9]. Металло-бета-лактамазы (MBL) — карбопенемазы, содержащие металл, обычно цинк, в своем активном центре, которые вызывают множественную лекарственную устойчивость [10]. Есть исследования, направленные на изучение распространения MBL-карбапенемаз среди K. pneumoniae [11]. Ранее MBL не были распространены у Enterobacteriaceae, однако сейчас ситуация меняется [12]. Таксономическая принадлежность рассматриваемой бактерии [1]:

Домен	Bacteria
Филум	Pseudomonadota
Класс	Gammaproteobacteria
Порядок	Enterobacterales
Семейство	Enterobacteriaceae
Род	Klebsiella
Вид	Klebsiella quasipneumoniae

2 Методы и материалы

Данные генома были получены из базы данных NCBI. Построение гистограмм длин белков {1}, GC состава генома {2}, диаграмм частот встречаемости старт кодонов {3}, а также поиск MBL генов {5} осуществлялся с помощью формул COUNTIFS, VLOOKUP и фильтров в Google Sheets. Подсчет количеств различных старт кодонов осуществлялся с использованием команд echo, cut, grep и sort языка Bash {4} Поиск организмов, где чаще всего встречаются конкретные последовательности генов MBL и последовательности плазмид осуществлялся с использованием алгоритма BLAST, а точнее blastn.

3 Результаты и обсуждения

3.1 Длины белков, закодированных в геноме бактерии Klebsiella quasipneumoniae

Рис 1. Гистограмма длин белков (длины измеряются в аминокислотах, карман — диапозон длин)

Как видно из рис 1 больше всего белков имеют длины 75-375 аминокислот, в данной бактерии присутствуют даже белки, длиной более 1200 аминокислот.

3.2 GC состав генома бактерии Klebsiella quasipneumoniae

Гистограмма GC состава — Рис 2. Гистограмма GC% состав CDS (карман – диапозон GC% состава)

Из рис 2 можно сделать вывод, что в геноме данной бактерии в основном 57.5 - 62.5% нуклеотидов GC. Кроме того, подавляющая часть последовательностей CDS имеет процент GC больше 50.

3.3 Частоты встречаемости старт кодонов в геноме бактерии Klebsiella quasipneumoniae

Рис 3. Диаграмма встречаемости старт кодонов в псевдогенах

Рис 4. Диаграмма встречаемости старт кодонов в белок-кодирующих CDS

Диаграмма встречаемости всех старт кодонов — Рис 5. Диаграмма встречаемости старт кодонов во всех CDS

В белок кодирующих CDS гены в основном начинаются со старт кодона AUG, однако достаточно распространены также старт кодоны GTG и TTG (рис 3). В псевдогенах наблюдается гораздо большая вариативность старт кодонов (рис 4), что неудивительно, так как регуляция трансляции псевдогенов не так важна, как регуляция трансляции белок кодирующих генов. Однако, так как в геноме псевдогенов гораздо меньше, чем белок кодирующих генов, в общем рассмотрении старт-кодонов CDS все равно превалируют ATG, GTG и TTG (рис 5). Последние два являются достаточно распространенными в геномах бактерий. На пример, не каноничные старт кодоны могут компенсироваться мутациями в других инициаторных элементах, для более сильного сигнала инициации трансляции [4]. Так же другие варианты старт кодонов могут служить механизмом дополнительной регуляции [3].

3.4 Изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы

Были рассмотрены гены, кодирующие один из типов карбапенемаз — металло-бета-лактамазы. Оказалось, что все 8 таких генов находятся в основном геноме, а не в плазмидах. При анализе последовательности этих генов, было обнаружено, что такие же гены присутствуют в хромосомных геномах Klebsiella pneumoniae и Klebsiella variicola (таблица 1).

Таблица 1. Результаты blastn по генам MBL

Идентификатор	Организм, где чаще всего встречается наиболее близкая к этому последовательность
WP_004205106.1	Klebsiella pneumoniae
WP_064150901.1	Klebsiella pneumoniae
WP_048324480.1	Klebsiella sp.
WP_043519632.1	Klebsiella pneumoniae
WP_167875398.1	Klebsiella variicola
WP_004201404.1	Klebsiella variicola
WP_025999133.1	Klebsiella pneumoniae
WP_004206319.1	Klebsiella pneumoniae

Такое совпадение может быть получено по некоторому ряду причин. Во-первых, эти бактерии очень близкие родственники, поэтому схожесть генома неудивительна. Во-вторых, как известно, у этих бактерий очень развит горизонтальный перенос генов [7], поэтому вполне вероятно, что эти гены передаются между данными бактериями.

3.5 Изучение плазмид бактерии Klebsiella quasipneumoniae

Данная бактерия содержит 2 плазмиды. Анализ последовательностей этих плазмид показал, что они обе очень похожи на плазмиды многих образцов Klebsiella pneumoniae. Более длинная плазмида (NZ_CP065839.1 - 144959 bp) на 100% процентов совпадает с участком последовательности лишь одного образца Klebsiella pneumoniae, в остальных случаях только на 60-70%. Такие результаты могут быть обусловлены их родством или горизонтальным переносом генов, так как, как известно, данные 2 вида обмениваются плазмидами [2,7]. Также, последовательность этой плазмиды на 75% совпадает с участком генома плазмиды Escherichia coli в одном из образцов. Это достаточно неожиданный результат, который может быть вызван случайностью или горизонтальным переносом генов. Вторая плазмида короче (NZ_CP065840.1 - 3478). Она была обнаружена в последовательностях плазмид многих образцов Klebsiella pneumoniae, также не маленький процент схожести с этой последовательностью имели образцы плазмид других Klebsiella. Однако вновь наблюдается несколько неожиданных образцов в выдачи BLAST. Pseudomonas aeruginosa содержит в своем хромосомном геноме ровно такую же последовательность, а эти бактерии совершенно не родственники (Pseudomonas aeruginosa - g-proteobacteria, Klebsiella quasipneumoniae - Enterobacteriaceae). Есть информация, что устойчивость к карбапенемам встречается у Pseudomonas aeruginosa [9,13], возможно поэтому такая схожесть плазмид не случайна. Немаленький процент схожести наблюдался у нескольких образцов других Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia coli. Вновь становится непонятно, это горизонтальный перенос или случайность.

4 Возможные дальнейшие исследования

Было бы интересно попробовать изучить причину схожести генов металло-бета-лактамаз и последовательностей плазмид у родственных бактерий Klebsiella quasipneumoniae. Близкородственность или горизонтальный перенос генов? Можно изучить, почему не родственные бактерии имеют такие же плазмиды как рассматриваемая. Случайность или снова горизонтальный перенос генов? Это очень важный вопрос, потому что если Klebsiella quasipneumoniae передает плазмиды настолько широко, то опасность масштабной резистентности к бета-лактамным антибиотикам увеличивается в разы. Также, было бы интересно изучить другие карбапенемазы на предмет схожести с родственниками рассматриваемой бактерии.

5 Благодарности

Спасибо большое всем преподавателям за полезные пары на протяжении всего семестра, многие новые знания и навыки были использованы во время написания миниобзора. Спасибо преподавателям сборной Москвы по биологии за то, что в прошлом году научили пользоваться алгоритмом Blast. А также, хочу выразить благодарность своим однокурсникам за моральную поддержку.

Миниобзор генома бактерии Klebsiella quasipneumoniae

Балакина Ольга Александровна

Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.