Сигналы и мотивы

Описание мотива в белках паттерном

Мы решили поискать мотив в белках RpoA. Это альфа-субъединица РНК-полимеразы. Он играет важнейшую роль в сборке фермента, узнавании промоторов и взаимодействии с регуляторными белками, обеспечивая инициацию транскрипции.
Файл с мнемониками

Скачали 10 фаста последовательностей по мнемоникам типо sw:RPOA_*, из файла ENTRIES:

seqret -filter 'list::ENTRIES' -outseq query.fasta

Выровняли MSAProbs в программе JalView. Файл с выравниванием

Нашли примерно посередине белка консервативный блок длиной 14 аминокислот:
40 - 53 в выравнивании
В белке RPOA_BARHE это аминокислоты с 32 до 45

По данной последовательности можно составить следующий мотив:

P-[LF]-E-[RPKA]-G-[FYL]-[GA]-x-T-[LV]-[GA]-[NH]-x-L

Запустили fuzzpro:

fuzzpro -sequence /P/y24/term4/bacteria-sw.fasta -pattern "P-[LF]-E-[RPKA]-G-[FYL]-[GA]-x-T-[LV]-[GA]-[NH]-x-L" \n
-outfile motifs_rpa.txt

466 находок, a в UniProtKB 628 результатов по запросу (id:RPOA_*) AND (taxonomy_id:2). Какие-то не нашлись. Попробуем ослабить паттарн:
P-[LF]-E-x-G-x-[GA]-x-T-[LV]-[GA]-[NH]-x-L — 514 находок с мнемоникой RPOA_*
P-[LF]-E-x-G-x-[GA]-x-T-x-[GA]-[NH]-x-L — 547 находок. Остановимся на этом результате, потому что дальнейшее ослабление паттерна делает его не очень релевантным.

Поиск мотивов в белках программой MEME и поиск этих мотивов в банке

Запустили MEME. Она поищет мотивы в белках:

 meme rpa.fasta -protein -mod oops -nmotifs 3 -minw 8 -maxw 15 -oc meme_out

-protein 		— последовательности аминокислотные
-mod oops		— если мотив встретился несколько раз в одной последовательности, считать за один
-nmotifs 3 		— количество найденных мотивов в одной последовательности 
-minw 8 -maxw 15 	— минимальная и максимальная длина мотива
-oc meme_out 		— указание папки для выходных файлов

Два главных файла в выдаче MEME:
meme.txt
meme.html

Запустили MAST. Он поищет мотивы, которые нашёл MEME, в базе всех белков бактерий:

 mast meme_out/meme.txt /P/y24/term4/bacteria-sw.fasta -oc mast_out

mast.html

На странице с выдачей MAST указано, что 655 последовательнонстей имеет E-value < 10. А также что показанные совпадения мотивов имеют p-value для позиции меньше 0,0001. Это очень хорошо.
По блоковой диаграмме видно, что зелёный мотив (GVEILNPDHHIATLN) может встретиться дважды. Вариативный повтор следует до основного.
Голубой мотив (PLERGYGYTLGNSLR), который мы нашли глазами в первом задании, может встретиться второй раз, после зелёного (GVEILNPDHHIATLN)

motifs in rpa — **Рис.3** Варианты положения найденных мотивов в белках с выбранной мнемоникой

Последняя находка с нужной мнемоникой имеет E-value 2.3e-5. Всего находок с нужной мнемоникой 646, есть ещё 9 находок других белков с E-value более чем 2.1e-1 ≈ 0,21.

Поиск последовательности Шайна — Дальгарно в геноме своего прокариота

Последовательность Шайна—Дальгарно это рибосом-связывающий сайт у бактерий — короткий мотив перед старт-кодоном. Обычно это AGGAGG ~в 10 п.о. от старт-кодона.

Мы будем анализировать скачанный в первом семестре геном бактерии Bartonella krasnovii

Всего CDS в скачанном геноме 1790. CDS without_protein всего 81. Это различные РНК и псевдогены.

Поискали паттерн AGGAGG на (+) и (-) цепи:

fuzznuc -sequence ~/term1/genome/GCF_003606345.3_ASM360634v3_genomic.fna -pattern AGGAGG -complement N -outfile plus.txt
fuzznuc -sequence ~/term1/genome/GCF_003606345.3_ASM360634v3_genomic.fna -pattern CCTCCT -complement N -outfile minus.txt

На плюс цепи 424 находок + 362 на минус цепи = 786 находок. То есть по этой оценке мы нашли примерно 786 белков среди всех CDS.

Различие частоты находок мотива в геноме и случайного совпадения тех же букв.

Программой compseq посчитали частоты нуклеотидов. Из выдачи, нам нужна графа Obs Frequency
То есть, согласно этим частотам, вероятность получить последовательность AGGAGG, если это случайные независимо распределённые буквы: P(AGGAGG) = P(A)² * P(G)⁴ = (0.3132427)² * (0.1905419)⁴ = 12,9 * 10^-5.
А количество находок в геноме тогда: P(AGGAGG) * длина генома * 2 (за две цепи)= 12,9 * 10^-5 * 2186621 * 2 = 564

Однако мы нашли 786, что в 1,4 раза больше, чем 564.

При больших n и маленьких p биномиальное распределение апроксимируется Пуассоновским. При λ = 564 и наблюдаемом числе сайтов k = 786 z критерий составляет :
z ≈ (786 - 564) / 23.75 ≈ 9.35
Поскольку z >> 1.96 ( при стандартном пороге alpha = 0.05), формально это большое отклонение и это не случайные буквы в геноме. Мы должны отвергнуть нулевую гипотезу о том, что наблюдаемое число сайтов последовательности Шайна-Дальгарно соответствует случайному ожиданию. Наблюдаемое число сайтов значимо превышает то, которое стоило бы ожидать при случайном распределении нуклеотидов, что говорит о том, что это мотив, а не случайный набор букв.

Находки, располагающиеся в правильной позиции

Последовательности Шайна-Дальгарно есть не у каждого гена белка. Например, среди находок на реальную поселедовательность ШД похожи следующие:

начало ПШД       начало CDS

 41971		   41 982
 98425		   98 437

остальные лежат дальше 20 нуклеотидов от начала CDS в некодирующих областях генома.

В целом, после просмотра предсказанных мотивов стало понятно, что большинство предсказанных находок лежат в некодирующих частях, то есть не являются истинными ПШД.