Часть I. Анализ качества чтений. Очистка чтений

fastqc chr8.fastq

java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar 
	SE -phred33 chr8.fastq out1.fastq TRAILING:20

java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar
	 SE -phred33 out1.fastq out2.fastq MINLEN:50

fastqc out2.fastq

Per base sequence quality (до и после чистки)

Число чтений до чистки: 8367
Число чтений после чистки: 8227
С помощью программы trimmomatic были удалены нуклеотиды с качеством чтения
(меньше 20, где Q=10*lg(p), p - вероятность ошибки)
Отобраны прочтения с длиной более 50 нуклеотидов
Пропали риды с длинными усами
В результате проведенной нами небольшой чистки количество прочтений уменьшилось на 140

Стоит обратить внимание на такой параметр как Per sequence GC content;
содержание GC пар изменилось с 39 до 38 %, тем не менее, до "чистки" рядом с этим параметром стояло
предупреждение (имеются отклонения от нормального распределения содержания GC-пар в более чем 15% прочтений),
после trimmomatic процент отклонения по прочтениям уменьшился, предупреждение пропало
Вероятно, предупреждение было связано с наличием коротких прочтений, которые вносили погрешности в подсчет
распределения процентного содержания GC-пар

Мы также можем заметить предупреждение напротив параметра Per base sequence content
Они возникает, если различие между А и Т, либо G и C больше 10% в какой-либо позиции
Это может быть связано с ошибкой в процессе секвенирования; скорее всего, это не опосредовано
присутствием какой-либо "загрязняющей" последовательности, иначе такие неточности систематически
появлялись бы в нескольких позициях, а не только в одной, как в нашем случае

Per base sequence content (до и после чистки)

Sequence Length Distribution
Этот модуль генерирует график, показывающий распределение размеров ридов в анализируемом файле
Предупреждение возникает, если все прочтения имеют различную длину
В нашем случае длина ридов в большинстве случаев превышает 100 bp;
Не думаю, что в случае нашего файла такое предупреждение является серьезной проблемой, так как
данный параметр достаточно сильно зависит от качества секвенатора; так, если прибор не является
высокопроизводительным, то небольшие различия в длине ридов для него являются нормой

Sequence Length Distribution (до и после чистки)

Часть II. Картирование чтений

hisat2-build chr8.fasta mychr

hisat2 -x mychr -U out2.fastq -S samchr8.sam --no-spliced-alignment --no-softclip

samtools view samchr8.sam -b >> bamchr8.bam

samtools sort bamchr8.bam sortedbam

samtools index sortedbam.bam

Рассмотрим выдачу программы hisat2 - на геном откартировано 3227 ридов,
100% которых были непарными
8187 ридов (99.64%) выровнены ровно 1 раз
30 ридов (0.36%) выровнены 0 раз
0 ридов (0%) выровнены более 1 раза

С помощью команды

samtools depth sortedbam.bam >> cover.csv

samtools depth -r chr8:76476210-76479061 sortedbam.bam >> exon_cover.csv