Анализ ЯМР-файла

Для сравнения структур, полученных методами ЯМР и РСА, был выбран маленький белок рубредоксин из организма Clostridium pasteurianum. Этот белок связывает один атом железа Fe³⁺(окисленная форма) и участвует в реакциях одноэлектронного переноса. Для него были получены ЯМР-структура (1BFY) и РСА-структура (1FHH). Обе структуры приведены на Рис. 1.

Разрешение РС-структуры: 1.5 Å
Количество структур в ЯМР-файле: 20

Рис 1. Наложенные структуры белка рубредоксина, полученные методами ЯМР (20 состояний цепи, показаны бордовым) и РСА (1 структура, обозначена голубым). Комплекс содержит атом железа (показан желтым).

По Рис. 1 видно, что структуры, полученные разными методами, хорошо совмещаются друг с другом.

Далее была оставлена только структура 1FHH (модель, полученная рентгено-структурным анализом), и для нее с помощью команды
dist bond_h, donors, acceptors, 3.5, mode=2 (donors, acceptors - стандартно заданные в Pymol множества) были показаны все водородные связи (Рис. 2). Водородными связями в данном случае называем связи между электроотрицательными атомами доноров и акцепторов, находящихся на расстоянии не больше 3.5 Å друг от друга.

Рис 2. Все водородные связи на расстоянии меньше или равном 3.5 Å для структуры рубредоксина, полученной методом РСА. Комплекс содержит атом железа (показан оранжевым). Белок изображен в виде палочной структуры и покрашен по типу атомов.

Затем были выбраны и визуализированы несколько водородных связей из разных частей белковой глобулы (Рис. 3 - 6). Их представленность в ЯМР-файле также была оценена по каждой из 20 структур файла 1BFY.

Рис 3. Наверху: 2 водородные связи между остовными атомами **Tyr'4/N и Tyr'13/O** в РСА-модели рубредоксина **1FHH**. Внизу: положение остатков Tyr'4/N, Tyr'13/O в белковой глобуле (весь белок покрашен в бирюзовый, остатки отмечены красным).

На Рис. 3 приведен пример внутрибелкового взаимодействия атомов остова полипептидной цепи - 2 водородные связи между (маленькими) бета-слоями. Длины связей - 2.9 Å и 2.7 Å.

Рис 4. Наверху: Водородная связь между кислородом боковой цепи и остовным азотом остатка **Asp'36** в РСА-модели рубредоксина **1FHH**. Внизу: положение остатка Asp'36 в белковой глобуле (весь белок покрашен в бирюзовый, остаток отмечен красным).

Интересный вариант образования водородной связи можно наблюдать на Рис. 4, где аспартат, находясь на поверхности белковой глобулы в неупорядоченной петле, кислородом боковой цепи образует водородную связь со своим же атомом азота, входящим в остов. Длина связи 3 Å, а угол донор-акцептор-водород составляет 40.8° - то есть водородная связь довольно искривлена по сравнению с типичными случаями, в которых величина угла не превышает 20°.

Рис 5. Наверху: Водородная связь между атомами боковых цепей **Trp'37/NE1 и Asp'19/OD2** в РСА-модели рубредоксина **1FHH**. Внизу: положение остатков Trp'37 и Asp'19 в белковой глобуле (весь белок покрашен в бирюзовый, остаток отмечен красным).

На Рис. 5 показан вариант образования водородной связи прямо в core белковой глобулы. Это не очень хорошо отражено структуре всего белка (Рис.5, внизу), однако по верхнему рисунку видно, что аминокислотные остатки, участвующие в образовании связи, во-первых, относительно крупны, а во-вторых, ориентированы навстречу друг другу. Длина связи при этом составляет 2.7 Å, а угол наименьший из всех рассматриваемых в этом практикуме вариантов - 6,9° - то есть остатки расположены практически на прямой линии.

Рис 6. Наверху: Водородная связь между остовными атомами **Asp'32/N и Asp'29/O** внутри альфа-спирали в РСА-модели рубредоксина **1FHH**. Внизу: положение остатков Asp'32 и Asp'29 в белковой глобуле (весь белок покрашен в бирюзовый, остаток отмечен красным).

Наконец, на Рис. 6 приведен пример водородной связи внутри маленького фрагмента α-спирали. Длина связи 2.9 Å.

Затем эти же связи я искала во всех 20 структурах, представленных в ЯМР-файле 1BFY. В Таблице 1 приведены результаты поиска.

Таблица №1. Сравнение параметров водородных связей в структурах, расшифрованных с помощью РСА и ЯМР

Донор Акцептор Положение в белке Длина связи в РСА-структуре Встречаемость в ЯМР-моделях min длина связи ЯМР-моделях max длина связи ЯМР-моделях Медиана длины связи ЯМР-моделях

Tyr'4/N Tyr'13/O β-слой 2.9 Å 100 % 2.9 Å 3.0 Å 3.0 Å

Asp'36/N Asp'36/OD1 Поверхностная петля 3.0 Å 25 % 2.7 Å 2.9 Å 2.7 Å

Trp'37/NE1 Asp'19/OD2 Коровые петли белка 2.7 Å 10 % 2.6 Å 2.7 Å 2.65 Å

Asp'32/N Asp'29/O α-спираль 2.9 Å 100 % 2.7 Å 2.8 Å 2.7 Å

Из Таблицы 1 и из Рис. 7-8 (ниже) очевидным образом следует, что, несмотря на бОльшую динамичностью структуры белка в растворе в ходе ЯМР-эксперимента, связи, вовлеченные в формирование вторичных структур (β-слоя или α-спирали), представлены во всех ЯМР-моделях, поскольку являются биологически значимыми. В то же время, на поверхности белка стабильность водородных связей сильно ниже из-за более высокой неупорядоченности среды и структуры. Аминокислотный остаток в поверхностной петле свободно вращается вокруг своих торсионных χ-углов, в некоторых конформациях (25% случаев) образуя водородные связи с пептидным остовом. Наконец, довольно интересные данные получились с остатками, которые имеют общую водородную связь внутри белковой глобулы, однако они расположены на неупорядоченных петлях, из-за чего могу довольно свободно двигаться. Из-за этого, на самом деле, в растворе водородная связь, зафиксированная в кристалле, возникает всего в 10% случаев. Еще напрашивается замечание, что подвижность коровой части белка зависит от общего размера белка - в данном случае был выбран маленький рубредоксин, и, наверное, говорить о внутреннем ядре этого белка как таковом не очень корректно.

В заключение приведу примеры отсутствия/наличия водородной связи в той или иной ЯМР-модели (Рис. 7).

Рис. 7. Примеры водородных связей в ЯМР-моделях рубредоксина для аминокислотного остатка на поверхности белка (**Asp'36**). Белковая глобула показана с помощью cartoons, атом железа покрашен в оранжевый, а аминокислотный остаток, участвующий в образовании водородной связи, показан палочками и покрашен по типу атомов.

Рис. 8. Примеры водородных связей в ЯМР-моделях рубредоксина для аминокислотных остатков во внутренних петлях белка (**Trp'37/NE1 и Asp'19/OD2**). Белковая глобула показана с помощью cartoons, атом железа покрашен в оранжевый, а аминокислотные остатки, участвующие в образовании водородной связи, показаны палочками и покрашены по типу атомов.

На страницу седьмого семестра