Практикум 7

1. Выбор белка

В окне расширенного поиска на сайте UniProt в поле «Taxonomy [OS]» я ввёл название изучаемой бактерии с её TaxID: Salmonella typhimurium strain LT2. Поиск выдал 9918 записей. Для сужения поиска я сначала воспользовался фильтром «Protein Existence [PE]: Evidence at protein level», что сузило выбор до 670 записей. После я добавил еще один фильтр «Enzyme classification [EC]: 3.» (Класс гидролаз). Эти действия сузили выбор до 49 вариантов. После чего был выбран белок: Dihydroorotase.

2. Информация о белке

Дегидрооротаза — это внутриклеточный фермент, принадлежащий к классу гидролаз. У бактерий рода Salmonella он кодируется геном pyrC. Белок представляет собой гомодимер (состоит из двух идентичных субъединиц) и является металлоферментом: для его работы в активном центре необходимы ионы цинка. Белок играет критическую роль в метаболизме клетки, участвуя в пути биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов de novo. Фермент катализирует обратимую циклизацию N-карбамоил-L-аспартата в L-дигидрооротат с выделением молекулы воды. Это третья стадия синтеза пиримидинов. Продукт реакции (дигидрооротат) далее окисляется до оротата, который служит основой для формирования уридинмонофосфата (УМФ). Активность гена pyrC у сальмонеллы жестко регулируется концентрацией нуклеотидов в клетке через механизм «аттенюации» (преждевременного прекращения транскрипции), подробнее о механизме регуляции гена pyrC можно прочитать в исследовании: PMID: 2885307 «Nucleotide sequence and expression of the pyrC gene of Escherichia coli K-12».

3. Кластеры похожих белков

Для данного фермента известно, что размер кластеров UniRef100 состоит из 20 белков, UniRef90 состоит из 537 белков, а в состав кластера UniRef50 входит 1110 белков. Данные значения позволяют сделать вывод о том, что дегидрооротаза является довольно распространенным белком. Также, вероятно, этот фермент является неконсервативным, так как количество белков в кластере UniRef50 превышает размеры кластера UniRef90 почти в два раза.

4. Поисковые запросы

Первый запрос был составлен путем заполнения полей Enzyme classification [EC]: 3.5.2.3, Taxonomy [OC]: 40674. Данный запрос продемонстрировал что для млекопитающих характерно наличие 445 записей для дегидрооротазы. При этом если добавить еще одно поле Reviewed: Yes, то после применения поиска выдает всего 3 записи. Исходя из этого можно сделать вывод что 442 записи в UniProtKB для данного фермента получены из автоматической базы данных - TrEMBL, и всего 3 записи получены из курируемой базы данных - Swiss-Prot.

Второй запрос посвящен изучению кофакторов в ферменте. Из ранее проведенной работы известно, что для этого белка в Salmonella typhimurium strain LT2 в качестве кофактора характерно наличие ионов цинка. Использовав поля расширенного поиска в UniProtKB: Enzyme classification [EC]: 3.5.2.3, также выставив “NOT” перед полем ChEBI term: CHEBI:27365 (что соответствует иона цинка) - в ответ было выдано 7814 записей. Это значит что 7814 записей об этом ферменте из 33518 записей(число было получено через поле Enzyme classification [EC]: 3.5.2.3 в расширенном поиске) НЕ содержат ионы цинка в качестве кофактора.

Третий запрос был направлен на изучение внутриклеточной локализации фермента в таксоне Eukaryota. Сначала с помощью запроса Enzyme classification [EC]: 3.5.2.3, Taxonomy [OC]: 2759, я выяснил что существует 4228 записей о ферменте в эукариотических организмах. Далее к предыдущему запросу я добавил поле Subcellular location term: SL-0086 и выяснил что 1106 белков из записей локализованы в цитоплазме, аналогичным методом было показано наличие 892 записей о белках, располагающихся в ядре. Зайдя на случайно выбранную запись я заметил что дегидрооротаза может располагаться и в цитоплазме и в ядре. Затем был составлен поисковый запрос: Enzyme classification [EC]: 3.5.2.3, Taxonomy [OC]: 2759, Subcellular location term: SL-0086, Subcellular location term: SL-0191 - результатом которого стали 797 записей. Это значит что 797 белков могут локализоваться одновременно и в цитоплазме, и в ядре.