Ресеквенирование. Поиск полиморфизмов у человека

В данном практикуме мы работали с чтениями экзома, картирующимися на участок хромосомы человека.
Файл chr3.fastq с одноконцевыми чтениями в формате fastq был взят мной из директории /P/y14/term3/block4/SNP/reads.
Подготовка чтений осуществлялась в несколько этапов:
1. Анализ качества прочтений
2. Очистка чтений с последующим анализом и сравнением параметров прочтений до и после очистки

Анализ прочтений был осуществлен с помощью прогрммы fastQC, установленной на сервере kodomo. Результатом работы программы является zip архив и html файл, содержащий отчет о качестве прочтений.
Программа была запущена с помощью команды:
fastqc chr3.fastq

Анализ прочтений был осуществлен с помощью прогрммы fastQC, установленной на сервере kodomo. Результатом работы программы является zip архив и html файл, содержащий отчет о качестве прочтений.
Программа была запущена с помощью команды:
fastqc chr3.fastq

Очистка чтений проводилась с использованием программы Trimmomatic. Были удалены чтения с длиной менее 50 нуклеотидов и с концов каждого чтения были отрезаны нуклеотиды с качеством ниже 20.
Ниже приведена команда:
java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr3.fastq chr3_out.fastq TRAILING:20 MINLEN:50

Сравним параметры чтений до и после чистки. До чистки было 20932 чтений, после чистки стало 20570 чтений.
На рис.1 изображен контроль качества чтений до чистки, а на рис.2 - после чистки. Синяя линия - среднее качество чтений, центральные красные линии - медианы, желтые прямоугольники - интерквартальные размахи (разница между верхн. и нижн. квартилями; диапазон значений качества, при котором качество 25% чтений на данной позиции выше нижней границы, а 75% - не выше верхней).
Поле графика разделено на 3 полосы - зеленую, желтую и красную; попадание в данные полосы вышеперечисленных элементов графика позволяет сделать вывод о качестве чтений. После чистки все риды располагаются в зеленой области, следовательно, с помощью чистки мы получили надежные прочтения. Также после чистки стало меньше ридов, так как были удалены риды длинной меньше 50.

Рис.1. Контроль качества чтений до чистки

Рис.2. Контроль качества чтений после чистки

Чтения были откартированы с помощью программы hisat2. Программа была импортирована с помощью команды:
export PATH=${PATH}:/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5

Программа картирования была запущена с параметрами -x (путь к индексу) -U (путь к чтениям) --no-spliced-alignment (запрет на картирование с разрывами) --no-softclip (картирование без подрезания чтений).
Также необходимо было проанализировать полученное выравнивание. Для этого я использовала программу Samtools. Она работает с файлами SAM формата.

Оказалось, что на хромосому откартировалось 20510 ридов. 79 ридов не было откартировано вообще.

В результате были найдены 230 SNP. Из них были выбраны 3 штуки и описаны в таблице.

Далее необходимо было аннотировать полученные SNP. Аннотирование осуществлялось с помощью программы ANNOVAR.
Подготовка входных файлов включала удаление инделей из snp.vcf и использование скрипта convert2annovar.pl
Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/convert2annovar.pl.old -format vcf4 /nfs/srv/databases/ngs/ciara_mak/snp.vcf > /nfs/srv/databases/ngs/ciara_mak/snp.avinput
Далее провелась аннотация:

1. dbnsp

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.snp -build hg19 -dbtype snp138 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
Полученнные файлы:
1. rs.snp.hg19_snp138_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в dbsnp, то есть аннотированные в этой базе данных.
2. rs.snp.hg19_snp138_filtered- содержит отфильтрованные полиморфизмы, то есть, не имеющие rs в dbsnp.
3. rs.dbsnp.log - содержит отчет о работе команды.
Аннотация по базе dbsnp показала, что 177 полиморфизмов имеют rs, а 41 не имеют.

2. 1000genomes

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.1000genomes -buildver hg19 -dbtype 1000g2014oct_all snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
Полученнные файлы:
1. rs.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в 1000 genomes, и их частоты.
2. rs.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_filtered -содержит полиморфизмы, не имеющие rs в 1000 genomes.
3. rs.1000.log - содержит отчет о работе команды.
Аннотация по базе 1000 genomes показала, что 174 полиморфизмов имеют rs, а 44 не имеют. Дополнительно мы смогли узнать частоты аннотированных полиморфизмов.

3. GWAS

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
Полученнные файлы:
1. rs.gwas.hg19_gwasCatalog_dropped - содержит SNP, имеющие известное клиническое значение.
Файл оказался пустым, то есть аннотация не дала никаких результатов.
2. rs.gwas.hg19_gwasCatalog_filtered- содержит полиморфизмы, не имеющие rs в GWAS.
3. rs.gwas.log - содержит отчет о работе команды.
Аннотация по базе GWAS показала, что 218 полиморфизмов не имеют rs.

3. Clinvar

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.clinvar -dbtype clinvar_20150629 -buildver hg19 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
Полученнные файлы:
1. rs.clinvar.hg19_clinvar_20150629_dropped - содержит SNP, имеющие известное клиническое значение.
Файл оказался пустым, то есть аннотация не дала никаких результатов.
2. rs.clinvar.hg19_clinvar_20150629_filtered - содержит полиморфизмы, не имеющие rs в Clinvar.
3. rs.clinvar.log - содержит отчет о работе команды.
Аннотация по базе Clinvar показала, что 218 полиморфизмов не имеют rs.

4. Refgene

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -out rs.refgene -build hg19 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
Полученнные файлы:
1. rs.refgene.variant_function - содержит описание всех полиморфизмов.
2. rs.refgene.exonic_variant_function - содержит описание полиморфизмов внутри экзонов.
3. rs.refgene.log - содержит отчет о работе команды.
В данном случае SNP подразделяются на несколько категорий, которые отображены в первой колонке файла rs.refgene.variant_function. Они указывают, где находится данный полиморфизм - внутри экзона, интрона, гена некодирующей РНК и т.д.
Возможные категории:
exonic - полиморфизм внутри экзона (частично или полностью)
splicing - полиморфизм в пределах 2 bp от границы сплайсинга (число bp можно изменить)
ncRNA - полиморфизм полностью или частично входит в транскрипт, не имеющий аннотации как кодирующий
UTR5 - полиморфизм полностью или частично входит в 5-нетранслируемую область
UTR3 - полиморфизм полностью или частично входит в 3-нетранслируемую область
intronic - полиморфизм полностью или частично внутри интрона
downstream - полиморфизм в пределах 1-kb downstream от сайта окончания транскрипции (параметр может быть изменен)
upstream - полиморфизм в пределах 1-kb upstream от сайта начала транскрипции (параметр может быть изменен)
intergenic - полиморфизм на пересечении генов
В моём случае количество SNP: 198 intronic, 13 exonic, 2 UTR5, 4 UTR3, 1 intergenic

© Макиевская Кьяра, 2018