Практикум 12. Анализ транскриптомов. Bedtools

Задание №1. Подготовка референса и чтений

Командная строка	Функция
fastqc chr20.1.fastq	Обработка FastQC
java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr20.1.fastq chr20.1_trim.fastq TRAILING:20 MINLEN:50	Обрезание концов
hisat2-build chr20.fasta indexed	Индексирование
hisat2 -x indexed -U chr20.1_trim.fastq -S chr20.1_aligntoref.sam --no-softclip	Картирование чтений из fastq (по индексированной последовательности)
samtools view -b chr20.1_aligntoref.sam -o chr20.1_align.bam	Конвертнация в .bam
samtools sort chr20.1_align.bam chr20.1_align_sorted	Сортировка по координате в начале чтения
samtools index chr20.1_align_sorted.bam	Индексация отсортированного .bam
htseq-count -i gene_id -s no -m union -f bam chr20.1_align_sorted.bam /nfs/srv/databases/ngs/Human/rnaseq_reads/gencode.v19.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf -o count.sam >> ready.txt	Подсчитывает чтения по указанной разметке Опции: -f: формат входного файла -s: специфичность по цепи -i: атрибут разметки для feature -m: способ разрешения случаев перекрываний нескольких генов
grep -E -v '0$' ready.txt	Вытаскивает строки с попаданием чтений на гены

Задание №2. Анализ результатов FastQC

До обрезки:

После обрезки:

Результаты:

 Input Reads: 3565 Surviving: 3530 (99,02%) Dropped: 35 (0,98%)

В результате ~99% сохранились, что не особо отличаетя от изначальных данных.

Задание №3. Анализ картирования чтений

98.81% чтений были картированы на хромосому, качество можно считать довольно высоким

 3530 reads; of these:
	3530 (100.00%) were unpaired; of these:
	42 (1.19%) aligned 0 times
	3488 (98.81%) aligned exactly 1 time
	0 (0.00%) aligned >1 times
	98.81% overall alignment rate

Задание №4. Подсчёт чтений

Из файла, полученного при грепировании файла-результата команды htseq-count, узнаем, сколько ридов легли на конкретный ген.

	ENSG00000125835.13      2081
	ENSG00000251806.1       4
	__no_feature    274
	__ambiguous     1129
	__not_aligned   42

274 чтения не попали в гены, для 1129 возникла спорная ситуация (например, попадание в 2 гена одновременно), а 42 чтения не были выровнены.

Белок, кодируемый геном ENSG00000125835.13, является одним из нескольких ядерных белков, которые часто встречаются среди мелких частиц рибонуклеопротеинов U1, U2, U4 / U6 и U5 (snRNP). Эти snRNPs участвуют в сплайсинге пре-мРНК, и кодированный белок также может играть роль в сплайсинге пре-мРНК или структуре snRNP.