Секвенирование по Сэнгеру
В практикуме №6 нужно было получить последовательность ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора и составить отчёт о
проблемах при чтении хроматограмм. Для этого были обработаны две хроматограммы (с прямой
и с обратной цепочек), исправлены в них неправильно определённые секвенатором буквы.
Исправление происходило по выравниванию, то есть все N из одной цепи были заменены на нуклеотиды из другой,
все гепы так же были заменены на нуклеотиды из другой цепи, все непонятные места были исправлены вручную по хроматограммам путем сравнения
прямой и обратной цепи.
Чтобы разрешить оставшиеся неопределённости были выравняны хроматограммы
и в итоге была определена консенсусная последовательность
Хроматограммы были визуализированы помощью программы Chromas, из Chromas была экспортирована последовательность.
Также программа определила концевые нечитаемые участки хроматограммы.
Прямая цепь:
5'-участок: 26 нуклеотидов
3'-участок: после 377 нуклеотида (качество на 3'-конце насколько низкое,
что невозможно посчитать количество нуклеотидов)
Обратная цепь:
5'-участок: 61 нуклеотид
3'-участок: после 387 нуклеотида
Для прямой цепи процент шума практически нулевой на большей части длины, но
для обратной на лучших участках он составляет порядка 10%, а на худших превышает 50%.
Также в обратной последовательности шум распределен очень неравномерно, тогда как в прямой он остается постоянно низким.
На левой (прямая цепь) хроматограмме вместо N поставил g, потому что видно маленький пик гистидина и на обратной хроматограмме видно,
что там должен быть гистидин.
На правой (прямая цепь) хроматограмме вместо NN поставил ct, так как по хроматограмме не было понятно какие там нуклеотиды,
исправление было сделано по левой (прямая цепь) хроматограмме.
Так как на нижней (обратная цепь) хроматограмме плохо прочитались нуклеотиды (разлилась краска),
последовательность была восстановлена по верхней (прямая цепь) хроматограмме.
Плохая хроматограмма
Хроматограмму взял свою (обратная цепь). На изображении видно, что уровень шума настолько большой,
что большинство пиков наложены друг на друга, что, скорее всего, говорит о загрязненности материала образцами других ДНК,
а также имеется пятно краски, отобразившееся в виде очень высоких и широких пиков.