Описание полиморфизмов у пациента.

1. Анализ качества чтений.

Мне была дана 13 хромосома человека chr13.fasta и, соответственно, файл с ридами для той же хромосомы chr13.fastq (без адаптеров).

Сперва я выполнила анализ качества чтений с помощью программы FastQC. Я воспользовалась версией, установленной на сервере kodomo. В командной строке я написала: fastqc chr13.fastq

Программа выдала архив файлов chr13_fastqc.zip и отчет о работе программы chr13_fastqc.html.

2.Очистка чтений

Очистка чтений была выполнена с помощью программы Trimmomatic (версии, установленной на kodomo).
Использовавшаяся команда:
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chr13.fastq chr13_out.fastq TRAILING:20
MINLEN:50
Где TRAILING - удаляет с конца чтения нуклеотиды с качеством ниже указанного, а MINLEN - удаляет чтения с длиной меньше указанного числа.

В результате был получен очищенный файл chr13_trim.fastq, который был проанализирован с помощью программы FastQC.
Использовавшаяся команда:
fastqc chr13_out.fastq
На выходе получился файл с отчётом chr13_trim_fastqc.html.

Характеристики чтения до(слева)/после(справа) очистки

Per base sequence quality для последовательности приемлемо и до чистки, и после (программа не выдает предупреждение). Также видно, что после чистки больше нет "усов" (края статистически значимой выборки) выходящих из зеленой области, некоторые интерквартильные промежутки (желтые прямоугольники) уменьшились, математическое ожидание по качеству (синяя линия) повысилось. То есть качество чтений увеличилось. Таким образом, были вырезаны только низкокачественные чтения и остались чтения пригодные для работы.

3. Картирование чтений.

Сперва было необходимо проиндексировать референсную последовательность. Для этого я воспользовалась программой BWA (Burrows-Wheeler Aligner). Так как она установлена на сервере kodomo, то я запустила её, введя в командной строке:
bwa index chr13.fasta

Затем было построено выравнивание очищенных прочтений и референса в формате .sam по алгоритму mem. Для этого была использована команда:
bwa mem chr13.fasta chr13_trim.fastq > chr13.sam

На выходе я получила файл chr13.sam.

Анализ выравниваний

Теперь мне нужно было перевести его в бинарный формат .bam. Для этого я воспользовалась следующей командой пакета samtools:
samtools view chr13.sam -b -o chr13.bam

Опция -b меняет формат файла на .bam, а опция -o указывает на название выходного файла. В результате я получила файл chr13.bam.

Затем я отсортировала получившийся файл по координате начала чтения в референсе. Для этого я использовала команду:
samtools sort chr13.bam -T t.txt -o chr13_sort.bam

Опция -T позволяет записывать временные файлы в temp.txt, а не в stdout, а опция -o указывает на название выходного файла. В результате я получила отсортированный файл chr13_sort.bam. Затем было необходимо его проиндексировать, для чего я воспользовалась командой:

samtools index chr13_sort.bam

Результат: индексный файл chr13_sort.bam.bai. Для того, чтобы узнать сколько чтений откартировалось на геном, я воспользовалась командой:

samtools idxstats chr13_sort.bam > result.txt

В результате получен файл results.txt, в котором указаны название последовательности, длина последовательности (115169878) и число картированных чтений (11932). Получается, что все чтения были картированы.

5.Поиск SNP и инделей

Всего в файле snp.vcf указано 137 полиморфизмов, из них 6 вставок, 7 делеций и 122 замен. Покрытие и качество полиморфизмов встречается как хорошее (например качество 225.009 и покрытие 225), так и не очень (например качество 4.12848 и покрытие 3). Среднее значение качества - 77,76, покрытия - 17,42. В целом показатели достаточно нормальные.

6. Аннотация SNP.

Далее необходимо было аннотировать полученные SNP с помощью программы ANNOVAR. Для работы с программой, файл необходимо можифицировать. В первую очередь из файла snp.vcf были удалены все индели, полученный файл - snp_mod.vcf. Затем был использован скрипт convert2annovar.pl для получения файла snp.avinput:

perl /nfs/srv/databases/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 snp_mod.vcf -outfile snp.avinput

Далее аннтоции были получены с помощью скрипта annotate_variation.pl

Refgene

Refgene - база данных для метода аннотации полиморфизмов, основанного на изменении строении генов и межгенных участков при инделях или заменах. Программа выдает 3 файла: в первом (variant_function) суммарная информация о всех найденных SNP, во втором (exonic_variant_function) содержится информация о SNP в экзонах, а в третем (log) информация о процессе работы программы.

В результате работы скрипта полученны файлы: chr13.refgene.variant_function; chr13.refgene.exonic_variant_function ; chr13.refgene.log. Файл chr13.refgene.variant_function содержит описание всех полиморфизмов, в первой колонке содержатся категории snp, которые указывают на то, где находится полиморфизм (exonic-внутри экзона, intronic-внутри интрона и т. д.). А также в файле указано гетерозиготный (52) или гомозиготный (72) полиморфизм.

Категории:

• exonic - полиморфизм внутри экзона (частично или полностью)
• splicing - полиморфизм в пределах 2 bp от границы сплайсинга (число bp можно изменить)
• ncRNA - полиморфизм полностью или частично входит в транскрипт, не имеющий аннотации как кодирующий
• UTR5 - полиморфизм полностью или частично входит в 5′-нетранслируемую область
• UTR3 - полиморфизм полностью или частично входит в 3′-нетранслируемую область
• intronic - полиморфизм полностью или частично внутри интрона
• downstream - полиморфизм в пределах 1-kb downstream от сайта окончания транскрипции (параметр может быть изменен)
• upstream - полиморфизм в пределах 1-kb upstream от сайта начала транскрипции (параметр может быть изменен)
• intergenic - полиморфизм на пересечении генов

В категории, для которых указывается ген, попали 124 полиморфизма. Все они расположены на одном из двух генов - PHF11 или COL4A1.

Dbsnp

Тип аннотации: filter-based annotation.
Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -out chr13.dbsnp -build hg19 -dbtype snp138 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

Полученнные файлы:

1. chr13.dbsnp.hg19_snp138_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в dbsnp, то есть аннотированные в этой базе данных.
2. chr13.dbsnp.hg19_snp138_filtered - содержит отфильтрованные полиморфизмы (не имеющие rs в dbsnp).
3. chr13.dbsnp.log - содержит отчет о работе команды.

Судя по данным в файлах, 109 полиморфизмов имеют rs и 15 - неаннотированы. Гены без rs демонствируют в целом худшее качество и уровень покрытия.

1000 genomes

Тип аннотации: filter-based annotation.

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -out chr13.1000g -buildver hg19 -dbtype 1000g2014oct_all snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

Полученнные файлы:

1. chr13.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в 1000 genomes, и их частоты.
2. chr13.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_filtered - содержит полиморфизмы, не имеющие rs в 1000 genomes.
3. chr13.1000g.log - содержит отчет о работе команды.

Gwas

Тип аннотации: region-based annotation.

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -regionanno -out chr13.gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

Полученнные файлы:

1. chr13.gwas.hg19_gwasCatalog - содержит snp, имеющие известное клиническое значение.
2. chr13.gwas.log - содержит отчет о работе команды.

Clinvar

Тип аннотации: filter-based annotation.

Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -out chr13.clincar -buildver hg19 -dbtype clinvar_20150629 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

Полученнные файлы:

1. chr13.clinvar.hg19_clinvar_20150629_dropped - содержит snp, аннотированные в Clinvar.
2. chr13.clinvar.hg19_clinvar_20150629_filtered - содержит snp, не аннотированные в Clinvar.
3. chr13.clinvar.log - содержит отчет о работе команды.

Сводная таблица со всеми командами

Назад
На главную

© Кучеренко Варвара 2015