Сборка генома de novo

Подготовка чтений программой trimmomatic.

Мне был выдан код доступа проекта по секвенированию бактерии Buchnera aphidicola - SRR4240360.

Сначала был скачан архив с заданными ридами, который затем был распакован в папку /nfs/srv/databases/ngs/kucherenko командой gunzip. Затем из файлов в папке с адаптерами был создан один файл, содержащий все адаптеры, с помощью команды:

  cat *.fa > /nfs/srv/databases/ngs/kucherenko/adapters.fasta

Из полученного файла были удалены все адаптеры командой:

  java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240360.fastq SRR4240359_mod.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7

После этого были удалены нуклеотиды с низким качеством с концов ридов и риды длиной менее 30 нуклеотидов:

  java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240360_mod.fastq final.out TRAILING:20 MINLEN:30

В результате был получен файл final.out, с ридами после очистки. Далее для анализа использовалась команда:

  fastqc SRR4240360.fastq 
 fastqc final.out

Сравнение чтений до (слева) и после(справа) чистки

Размер файла (MБ)	832	798
Ссылка на страницу с отчетом	SRR4240360_fastqc.html	final.out_fastqc.html
Основные характеристики

Таким образом после чистки было удалено 319549 ридов (3,87% от общего числа) или 34 МБ - качество отдельных пар нуклеотидов повысилось.

Использование пакета velvet

Сначала были подготовлены k-меры длины 29, риды короткие и непарные (short):

  velveth velveth 29 -fastq -short final.out

Таким образом, в директории velveth находятся все результаты работы программы. Далее были собраны контиги на основе полученных k-меров:

  velvetg velveth

В итоге было получено 2 файла: contigs.fa содержит последовательности контигов и stats.txt, содержащий статистику.

Основные подсчеты по контигам проведены с помощью excel (ссылка на файл)

Информация о трех самых длинных контигах

ID контига	Длина	Покрытие	Файл с последовательностью
1	94956	43,68	con1.fasta
5	70305	49,35	con5.fasta
9	70300	42,00	con9.fasta

В нашем графе 1509 вершина, N50=67050, max 94956, total 707455, using 0/7935083 reads.

*Описание двух контигов с аномальным покрытием*
ID контига	Длина	Покрытие
632	59	1,58
1882	37	116,89

Случаи аномально большого покрытия, вероятно, объясняются сранительно малой длиной контигов.

Анализ

С помощью алгоритма megablast я сравнила каждый из трёх самых длинных контигов с хромосомой Buchnera aphidicola (CP009253). Контиги с аномально большим и аномально маленьким покрытием не выраниваются в blast из-за маленького размера. Query - исследуемый контиг, Subject - геном бактерии длиной 628164 пн.

Сравнение самых длиных контигов с хромосомой Buchnera aphidicola

ID контига	Координаты участка хромосомы (для одного мэтча)	Max score	Total score	Query cover	E value	Identities	Matches	Gaps
1	467412 to 474667	4047	32384	60%	0.0	77%	20	208/7389(2%)
5	35124 to 44693	8517	34072	71%	0.0	83%	13	130/9633(1%)
9	389348 to 398726	4748	30562	79%	0.0	75%	14	390/10884(3%)

Назад
На главную