Определение сайтов связывания данного транскрипционного фактора в данном участке хромосомы человека

Для работы был выдан файл chipseq_chunk55.fastq с ридами Illumina, полученными в результате ChIP-seq эксперимента. С помощью программы FastQC был проведен контроль качества прочтений.
Команда: fastqc chipseq_chunk55.fastq.


Информация о ридах в файле до чистки	Качество рида по основаниям

На диаграмме видно, что данные нуждаются в "чистке" (концы "усов" практически все в области низкого качества). Поэтому для этих целей было решено воспользоваться программой Trimmomatic.
Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chipseq_chunk55.fastq chunk55_new.fastq TRAILING:50 MINLEN:36.
Результат очистки — файл chunk55_new.fastqc, содержал 8552 последовательностей (в ходе работы Trimmomatic отсек порядка 22.4%). На диаграмме видно, что все "усы" теперь заканчиваются в "благоприятной" области.


Информация о ридах в файле после чистки	Качество рида по основаниям

Далее последовательности были откартированы на проиндескированный геном человека.
Команда: bwa mem /srv/databases/ngs/hg19/GRCh37.p13.genome.fa chunk55_new.fastq > chunk55.sam .

Перевод в бинарный формат: samtools view -b chunk55.sam -o chunk55.bam
Сортировка по координате в референсе начала чтения: samtools sort chunk55.bam chunk55_sorted.bam
Индексация: samtools index chunk55_sorted.bam
Получение информации и количестве откартированных ридов: samtools idxstats chunk55_sorted.bam

Картированные последовательности

Больше всего ридов откартировалось на chr4. Таким образом, мы можем устверждать, что данные чтения именно с этой хромосомы.

Далее для поиска пиков я воспользовалась программой MACS.
Команда: bwa mem macs2 callpeak -t chunk55.sorted.bam .
Результат: файлы chunk55_peaks.xls, chunk55_summits.bed, chunk55_peaks.narrowPeak.

Информация о пиках из выдачи MACS2:

chr	start	end	length	abs_summit	pileup	-LOG10(pvalue)	fold_enrichment	-LOG10(qvalue)	name
chr4	124401051	124401278	228	124401163	22.00	15.70197	7.32484	9.08797	chunk55_peak_1
chr4	124426828	124427099	272	124426971	36.00	29.83622	10.75581	20.37157	chunk55_peak_2
chr4	124446470	124446765	296	124446629	21.00	16.18124	7.85714	9.53217	chunk55_peak_3
chr4	124476588	124476871	284	124476774	29.00	27.93735	12.09677	19.49099	chunk55_peak_4
chr4	124521277	124521493	217	124521332	30.00	23.66802	9.39394	16.45623	chunk55_peak_5
chr4	124570929	124571230	302	124571121	23.00	18.63315	8.69565	11.89196	chunk55_peak_6
chr4	124898897	124899263	367	124899069	31.00	26.37031	10.52632	18.87879	chunk55_peak_7

Ширина пиков варьируется от 217 до 367. В таблице указаны показатели -log10pvalue и -log10qvalue. Чем выше эти параметры, тем ниже соответствующие показатели p-value и q-value, а следовательно, достовернее пик. Самым достоверным в нашем случае является пик 2, а наименее достоверным - пик 1.

Визуализация пиков проводилась в геномном браузере UCSC Genome Browser. Использовался файл chunk55_peaks.narrowPeak, в начало которого были предварительно напечатаны строчки: track type=narrowPeak visibility=3 db=hg19 name="my_peaks" description="chunk55_peaks" ; browser position chr4:124401000-124900000

Пики в геномном браузере

Наиболее достоверный пик (peak2)

Наименее достоверный пик (peak7)

Расстояние от начала до вершины пика 2 = 143, пика 7 = 172. Как мы можем видеть, ни один из этих пиков не пересекается с областями каких-либо генов.

Назад
На главную