Практикум 6

Сравнение предсказаний трансмембранных участков в бета-листовом белке

Я выбрала белок LPS-assembly protein LptD E. coli. Общепринятого названия на русском мне обнаружить не удалось, но если вольно переводить, то это белок, собирающий липополисахарид (ЛПС).

ЛПС синтезируется в цитоплазме, после чего с помощью транспортоной системы (Lpt - от LPS transport), состоящей из семи белков: LptA, ..., LptG (см. рис. 1). Комплекс LptB₂FG работает как ABC-транспортер и перемещает ЛПС из внутренней мембраны в периплазматическое пространство. LptC и LptA транспортируют ЛПС через периплазматическое пространство, а комплекс LptDE транслоцирует ЛПС через внешнюю мембрану на поверхность клетки (Xiaowei Dai et al.).

**Рис. 1** Схема взаимодействия белков LptA, ..., LptG (Xiaowei Dai et al.)

PDB ID: 4RHB (комплекс LptDE)
UniProt ID: LPTD_ECOLI
Организм: E. coli
Расположение: наружная мембрана клетки (OM, outer membrane)

В OPM для белка указано 26 трансмембранных участков:

TM segments: 1( 244- 249), 2( 257- 262), 3( 270- 278), 4( 285- 292), 5( 311- 319), 6( 327- 333), 7( 356- 363), 8( 370- 377), 9( 390- 398), 10( 406- 415),11( 429-440),12( 447- 456),13( 481- 491),14( 506- 517),15( 555- 566),16( 575- 583),17( 607- 614),18( 622- 627), 19( 637- 645), 20( 653- 657), 21( 684- 692),22( 699- 704),23( 714- 721),24( 728- 735),25( 751- 757),26( 769- 778)

Последовательность, скачанную из UniProt, подала на вход DeepTMHMM, и получила следующее:

**Рис. 2** График из выдачи DeepTMHMM. На верхней части схематически нарисовано, как белок располагается относительно мембраны, а на нижней - вероятность того, что данный участок последовательности находится в бета-листе, располагается в периплазме, либо снаружи клетки, или является частью сигнального участка, который обусловливает транспорт белка в нужную мембрану.

В основном, DeepTMHMM имеет довольно высокую степень увереннсти в предсказании.

Можно заметить, что просто по последовательности модель верно предсказала мембрану, в которой располагается белок. Обе модели предсказали по 26 трансмембранных участков, но, что интересно, это не совсем одни и те же (см. таблицу 1).

Таблица 1 Сравнение результатов, полученных из OPM и при помощи DeepTMHMM

№	Трансмембранные участки в OPM	Бета-листы, предсказанные DeepTMHMM
1	–	228-234
2	244-249	242-249
3	257-262	256-264
4	270-278	271-279
5	285-292	284-291
6	311-319	311-319
7	327-333	325-333
8	356-363	356-364
9	370-377	368-375
10	390-398	392-399
11	406-415	406-414
12	429-440	430-438
13	447-456	447-455
14	481-491	483-493
15	506-517	508-516
16	555-566	558-566
17	575-583	575-581
18	607-614	608-614
19	622-627	620-628
20	637-645	639-644
21	653-657	651-657
22	684-692	685-691
23	699-704	698-704
24	714-721	714-721
25	728-735	726-734
26	751-757	752-758
27	769-778	–

Из-за того, что в базе данных OPM нет первого трансмембранного участка, а DeepTMHMM не предсказала последний, получилось, что N- и C-концы располагаются в обоих случаях одинаково, а все участки между трансмембранными бета-листами обращены в разные стороны. Думаю, это стало возможно, потому что эти участки оказались не очень длинными, и их физические свойства не сильно повлияли на предсказание. Кроме того, границы трансмембранных участков из OPM не точно совпадают с предсказанными бета-листами, может быть потому, что это правда так, а может быть, например, в границы мембраны были установлены немного по-разному.

Вот так это всё выглядит:

**Рис. 3** Модель, скачанная из OPM (PDB ID: 4RHB), отмечены учатки, которые **аннотированы в OPM** как трансмембранные и то, что **DeepTMHMM предсказал** как бета-листы, а также **их пересечение**. Также показаны **внеклеточная сторона** и сторона мембраны, **обращённая в периплазму** и **ион Na⁺**. Всё остальное серое, а именно оставшаяся часть белка LptD и белок LptE (внутри LptD).

Бирюзовая альфа-спираль действительно, судя по этой структуре, находится внутри мембраны, хотя её окружение и не состоит из липидов, при этом DeepTMHMM её не стал аннотировать как бета-лист. Первой части белка, как раз до первого бета-листа, предсказанного DeepTMHMM, вообще в структуре нет, и сам этот участок там бесструктурный.

Сравнение предсказаний трансмембранных участков в альфа-спиральном белке

Данный белок: Y1621_HAEIN
Название: Putative metal transport protein HI_1621 (предположительно, транспортер металлов)
Организм: Haemophilus influenzae (гемофильная палочка, палочка Пфайффера – грамотрицательная патогенная бактерия)

Про функцию известно, в целом, только то, что есть предположение, что он может быть вовлечён в транспорт металлов.

Сравним трансмембранные участки, которые указаны в UniProt с тем, что предскажет DeepTMHMM:

Таблица 2 Сравнение результатов, полученных из UniProt и при помощи DeepTMHMM

№	Трансмембранные участки, указанные в UniProt	Трансмембранные альфа-спирали, предсказанные DeepTMHMM
1	6-26	12-26
2	38-58	40-52
3	-	63-73
4	72-92	77-92
5	94-114	102-117
6	136-156	136-153
7	165-185	170-189

DeepTMHMM предсказал на один трансмембранный участок больше.

Анализ белка с помощью PPM

Параметры PPM 3.0:

Number of Membranes: оставила 1, так как белок маленький, и вроде как не прошивает сразу две мембраны насквозь
Type of membrane: известно только то, что организм – грам-отрицательная бактерия, и в UniProt указана локализация в клеточной мембране, но неизвестно, в которой из двух, а они довольно сильно различаются по свойствам; поэтому, чтобы не угадывать, оставила значение undefined membrane
Allow curvature: не думаю, что клеточная мембрана бактерий сильно волнистая, так что оставила no
Topology (N-ter): так как DeepTMHMM предсказал для N-конца outside, поставила значение out, хотя бы даже для простоты сравнения
Coordinate file: прикрепила файл с предсказанной AlphaFold структурой
Include heteroatoms, excluding water and detergents, for positioning in membrane: гетероатомов в структуре, предсказанной AlphaFold, вроде быть не должно, какие каких-нибудь необычных аминокислот (тот же селеноцистеин было бы странно видеть в транспортере металлов)

Таблица 3 Сравнение результатов, полученных из UniProt, при помощи DeepTMHMM и PPM по структуре, предсказанной AlphaFold.

№	Трансмембранные участки, указанные в UniProt	Трансмембранные альфа-спирали, предсказанные DeepTMHMM	Трансмембранные участки, предсказанные PPM
1	6-26	12-26	10-29
2	38-58	40-52	36-52
3	-	63-73	66-74
4	72-92	77-92	75-91
5	94-114	102-117	97-118
6	136-156	136-153	131-157
7	165-185	170-189	166-191

Последние два столбца достаточно сильно похожи, хотя границы трансмембранных участков оказались немного в разных местах.

PPM предсказал такое положение мембраны:

**Рис. 5** Выдача PPM. Белок покрашен в спектр от **N-конца** к **С-концу**. Небольшая альфа-спираль, показанная стрелкой – та спираль, которая не была указана в UniProt.

Судя по тому, что приведено на странице белка в UniProt, степень уверенности AlphaFold в предсказании достаточно высокая, за исключением неструктурированного участка на C-конце. Уверенность рассчитывается "понуклеотидно", и выражается в виде скора 0 ≤ pLDDT ≤ 100.

■ – очень высокая степень уверенности (90 < pLDDT)
■ – высокая степень уверенности (70 < pLDDT < 90)
■ – низкая степень уверенности (50 < pLDDT < 70)
■ – очень низкая степень уверенности (pLDDT < 50)

**Рис. 6** Степень уверенности AlphaFold в предсказании третичной структуры.

Можно сказать, что это неплохо согласуется с тем, что предсказанные двумя методами трансмембранные участки достаточно хорошо соотносятся друг с другом.