BLAST

Работа со страничкой BLASTp

В начале предлагается указать, какую именно последовательность надо анализировать. Есть возможность выбрать конкретный участок белка. Далее надо уточнить, из какой базы данных требуется брать белки для выравнивания. Опциональные возможности: указать конкретный организм, а также исключить записи refseq с определёнными идентификаторами. Также можно выбрать алгоритм. На выбор даётся четыре:
1) Quick BLASTP - ускоренная версия BLASTP
Как это работает? (очень упрощённо)
1. найти кандидатов, не используя выравнивания (индексировать k-меры из баз данных и введённой последовательньсти)
2. провести выравнивания с кандидатами из топ-1500 и упорядочить выдачу, используя blastp
Такое ускорение даёт действительно внушительный выигрыш по времени. Так, для того, чтобы проанализировать протеом Shigella flexneri SP1 WGS используя BLASTP, требуется около 10 часов, в то время как для QuickBLASTP это время составляет 0.8 часов. Однако, надо держать в уме, что для identity, меньшем 65%[1], результаты Quick BLASPTP гораздо хуже, чем таковые для BLASTP, что говорит о том, что ускоренный алгоритм следует использовать для быстрого поиска очень близких белков.
2) blastp
3) PSI-BLAST (Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool)
использует построение позиционой матрицы (длина х 20, ij-й элемент соответсвует вероятности, что у близких последовательностей в позиции i стоит аминокислота j).
Как это работает?
Первая итерация идентична BLASTP. Затем генерируется множественное выравнивание последовательностей с самым высоким e-value (порог можно задать самостоятельно) и рассчитывается позиционная матрица. Она вылавливает консервативный паттерн, который записывается как новая матрица, в ней каждой позиции присвается оценка её консервативности. Затем производится повторный сеанс поиска, только последовательности отбираются по тому, соответсвуют ли они полученному профайлу. Затем из них отбираются последовательности с максимальным e-value, и всё повторяется заново. И так до момента, когда ни одна найденная новая последовательность не превзойдёт порога.
Главный вопрос: зачем это всё?
В эволюции 3D структура белков может быть консервативна даже при условии значительного расхождения последовательностей. PSI-BLAST как раз замечает такие нюансы.
4) PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST)
Это видоизменение PSI-BLAST, которое на вход получает определённый мотив, вокруг которого и выстраивает позиционную матрицу.
5) DELTA-BLAST (Domain Enhanced Lookup Time Accelerated BLAST)
использует Conserved Domain Database (CDD), ресурс NCBI, позволяющий идентифицировать консервативные домены в белковой последовательности. Кажому домену там сопоставлено множественное выравнивание и посчитана позиционная матрица. Благодаря использованию этой базы данных уходит потребность первичного запуска BLASTP, увеличивается скорость и DELTA-BLAST заявлен как алгоритм, который находит гомологов лучше, чем остальные алгоритмы.

Основные параметры:
1) max target sequences: порог количества последовательнотей, после которого алгоритм останавливается
2) short queries: автоматически устанавливать word size и другие параметры для небольших последовательностей
3) expect threshold: верхний порог e-value. E-value - величина, характеризующая математическое ожидание того, что в случайно в базе данных среди последовательностей такой же длины и такого же аминокислотно состава найдется последовательность, дающая такой же или более вес. Соответсвенно, чем меньше e-value, тем больше мы можем доверять выравниванию.
4) word size: длина k-меров, на которые разбиваются последовательности из баз данных и данная последовательность. В случае нуклеотид-нуклеотидного бласта для начала построения выравнивания требуется полное совпадения k-меров, в других разновидностях бласта неточные совпадения рассматриваются с точки зрения схожести двух последних, в результате делается вывод, выравнивать или нет.
5) max matches in a query range: эта опция полезна, если множество сильных совпадений с одной частью последовательности может помешать BLAST найти более слабые совпадения с другой частью последовательности.

Параметры оценки:
1) matrix: на выбор даются матрицы BLOSUM(INT) и PAM(INT). В случае BLOSUM число означает, что матрица была посчитана для последовательностей с меньшей, чем (INT), similarity. В случае PAM - PAM(INT) - это матрица, соответсвующая временному интервалу, достаточному для возникновения (INT) мутаций на 100 аминокислот.
2) gap costs: различия между различными видами штрафов знакомы из прошлого практикума. Надо помнить, что повышение gap opening penalty повышает частоту инделов в выравнивании, а gap extension penalty влияет на их размеры.
3) compositional adjustments: матрицу можно дополнительно улучшить. Сomposition-based statistics - самый простой подход, нормирует все scores для мест замен определённой аналитически константой, оставляя все scores с гэпами фиксированными. Этот подход универсален, а следующий, более замысловатый - compositional score matrix adjustment - выгодно применять только в определённых случаях. Он настраивает каждую оценку в матрице подстановок отдельно, чтобы компенсировать композиции двух сравниваемых последовательностей.

Фильтры и маски:
1) filter: low-compleqity фильтр нужен для того, чтобы биологический смысл полученных результатов превалировал над статистическим. Данная опция скрывает участки с высокой степенью вырожденности, например, гомополимерные участки, короткие тандемные повторы и перепредставленность определённых аминокислотных остатков.
2) mask: mask for lookup table only: применяется на этапе составления таблицы поиска для того, чтобы бласт не выдавал результатов с теми же участками с высокой степенью вырожденности. mask lower case letters: маскирует все аминокислоты, введённые в нижнем регистре.


Поиск гомологов

Я провела три сеанса поиска в BLAST, во всех трёх я изменила базу данных на swissprot и ограничение на число находок на 20000. Мне было интересно, будут ли значительно различаться выдачи разных алгоритмов, поэтому я провела сеансы поиска с blastp (по умолчанию), PSI-BLAST и DELTA-BLAST. В случае DELTA-BLAST средний показатель identity был самым низким (в районе 30%, в то время как для других алгоритмов - 37%). Однако alignment scores получились в среднем сильно больше - порядка 500 (причём scores первого и, например, десятого объекта выдачи различаются на 17 баллов), в то время как для двух других показатели score очень похожи: первый результат выдачи имеет score 766 и отличается от десятого на 495 баллов.
Скорее всего такое сильное расхождение результатов объясняется моими малыми познаниями, так как получение адекватных результатов из DEPLTA-BLAST "требует значительных знаний и хорошей интуиции, а поэтому запуск таких иттеративных алгоритмов - более сложная задача, чем просто запустить blastp" (ИР, большое спасибо за ответ). Поэтому дальнейшая работа производилась с результатами blastp.

Таблицы
BLASTp
PSI-BLAST
DELTA-BLAST

Рис.1 Результаты работы BLAST, слева направо: blastp, PSI-BLAST, DELTA-BLAST



Рис.2 Выдача BLASTp


Рис.3 Выдача PSI-BLAST


Рис.4 Выдача DELTA-BLAST


Первый результат выдачи с E-value 0 - сам белок. Забавно, что единственная лизин-рацемаза в выдаче - как раз данный белок Oenococcus oeni. Все наиболее близкие к нему белки носят название аланин-рацемаз. Данный вопрос затрагивался мной при выполнении практикумов в прошлом семестре, интересно, что аланин-рацемаза может катализировать рацемизацию и аланина, и лизина, а лизин-рацемаза - только лизина. Посмотрим же на выравнивания, чтобы понять, почему так.

Выравнивания
Одна из последовательностей была взята из Geobacillus stearothermophilus, потому что аланин рацемаза данного организма сравнивается с рассматриваемой лизин-рацемазой в статье [2], которую я разбирала для практикума в прошлом семестре. В таблице 1 представлены все последовательности, бравшиеся для выравнивания. Указанные в статье изменённые остатки в активном центре действительно отличаются для лизин-рацемазы, причём у всех остальных найденных белков подобных замен нет.
Таблица 1. Последовательности, бравшиеся для выравнивания.


Рис. 5. Выравнивание. Простите, с css я раздружилась за долгое время, а всё это красивое выравнивание хочется показать целиком.

Скачать jalview проект
Данные белки гомологичны, так как присутствует блок (рис. 6) длины 7, начинающийся и заканчивающийся абсолютно консервативной позицией, без колонок с гэпами, и в котором высока плотность консервативных позиций.


Рис. 6. Блок выравнивания.
Итак, какие выводы о лизин-рацемазе мы можем сделать на основании данного выравнивания? Построим дерево по методу Neighbourhood joining с использованием BLOSUM62 (рис. 7).


Рис. 7. Дерево, построенное на основе выравнивания.
Интересно, что изучаемая лизин-рацемаза (Q04HB7) отстоит от большинства остальных рацемаз, следовательно, отделение лизин-рацемазы от ветви аланин-рацемаз произошло довольно рано. Однако самым дальним белком является аланин-рацемаза Halothermothrix orenii из класса Clostridia, что закономерно, так как все остальные белки принадлежат бактериям из класса Bacilli.

Карта локального сходства белков

Были рассмотрены белки с идентификаторами A0A163IMY9_DIDRA и FOL1_DICDI. Первый - дигидронеоптерин-альдолаза (dihydroneopterin aldolase) аскомицета Didymella rabiei, участвующая в процессе синтеза фолата. Второй белок - FOL1 (фолат-синтезирующий белок) Dictyostelium discoideum



По вертикали расположена дигидронеоптерин-альдолаза (268 а.о.), по горизонтали - FOL1 (657 а.о.). Видна дупликация в FOL1 и мелкие инделы. Выравниваются начало дигидронеоптерин-альдолазы и середина FOL1. e-value для двух полученных выравниваний довольно мал, поэтому оба выравнивания использовались для анализа.



Игры с BLAST
Последовательность, по которой производился поиск: GIVEPEACEACHANCE. На рис. 6 видно, что эта последовательность символов не является естественной для живых организмов. Только АТФ-зависимая рРНК хеликаза RRP3 из паразитического гриба Pyricularia oryzae показала 83.33% identity, хотя все остальные показатели плохие, и эти белки нельзя считать гомологичными.



Рис. 6. Результаты для последовательности GIVEPEACEACHANCE.

Затем я дала на вход монолог Лаки из "Ожидания Годо"[3] без пробелов и с символами высокого регистра (2751 символов, были убраны буквы, не соответсвующие аминокислотам). Не было выдано никаких результатов, этот монолог даже в виде набора аминокислот бессмысленен.
Однако если уменьшить параметр word size до трёх, будет найдено 4 соответствия. Между прочим, одно из них принадлежит автотранспортеру ROD_p1121 (D2TV88). Это белок, находящийся на мембране Citrobacter rodentium, и total score для него составляет 78.9, а e-value 0.052. Всё же показатели max score, query cover и per. ident. для данного белка неубедительные. Были найдены негомологичные белки из разных групп организмов, например, один из четырёх принадлежит Homo sapiens.

[1] http://mirrors.vbi.vt.edu/mirrors/ftp.ncbi.nih.gov/blast/documents/researchfestivalpages.pdf
[2] Shiro Kato, Hisashi Hemmi, Tohru Yoshimura; Lysine racemase from a lactic acid bacterium, Oenococcus oeni: structural basis of substrate specificity, The Journal of Biochemistry, Volume 152, Issue 6, 1 December 2012, Pages 505–508, https://doi.org/10.1093/jb/mvs120
[3] https://resources.saylor.org/wwwresources/archived/site/wp-content/uploads/2011/01/Waiting-for-Godot.pdf