Исследование ДНК-белковых взаимодействий в структуре комплекса белка FADR и оператора FADB

Краткое описание структуры в файле 1h9t.pdb

1h9t.pdb
В файле приведены координаты атомов следующих молекул: белок FADR (регулятор метаболизма жирных кислот) в комплексе с FABD оператором (участок ДНК, с которым связывается регуляторный белок FADR) из организма E.coli. Для исследования были выбраны цепи белка A и В и цепи X и Y, представляющие ДНК со следующей последовательностью:

цепь X  [1] 5' - catctggtacgaccagat - 3' [19]
                 ||||||||||||||||||
цепь Y [19] 3' - gtagaccatgctggtcta - 5' [1]  

Функции белка FADR_ECOLI
(Взято в банке UniProt, код доступа белка P0A8V6)

Мультифункциональный регулятор метаболизма жирных кислот. Подавляет транскрипцию по крайней мере восьми генов, необходимых для транспортра жирных кислот и бета-окисления. Активирует транскрипцию как минимум трёх генов, необходимых для биосинтеза ненасыщенных жирных кислот. Связывание FADR специфично ингибируется веществами с длинным цепочечным жирным ацил-CoA. C-концевой домен связывает ацил-CoA.

Исследование структуры ДНК

Для исследования структуры ДНК были использованы программы find_pair и analyze, а именно выходной файл последней с расширением ".out".

Затем с помощью программы MS Excel были просчитаны средние значения торсионных углов каждого нуклеотида, которые были получены в приведённом файле. Расчёты в Excel:

	α	β	γ	δ	ε	ξ	χ
1h91	-36,4	-171,8	15,2	141,3	-170,9	-110,7	-112,1
ДНК A	-62	173	52	88 или 3	178	-50	-160
ДНК B	-63	171	54	123 или 131	155	-90	-117

Хотя средние значения углов исследуемой ДНК довольно сильно отличаются углов от обеих форм, она ближе к B-форме.

На одном из листов в приведённом файле Excel имеется таблица с отклонениями торсионных углов от средних значений. Самым "кривым", на мой взгляд, является нуклеотид C4 на цепи X.
Отклонения его углов:

α	β	γ	δ	ε	ξ	χ
112,4	37,5	175,4	26,3	17,7	46,8	43,4

Как видно из таблицы, угол γ почти на 180 градусов повёрнут относительно среднего угла, то есть это диаметрально противоположный угол. Поэтому, на мой взгляд, связывание белка может приводить к значительным деформациям молекулы ДНК.

Исследование природы ДНК-белковых контактов

С помощью программы RasMol были определены взаимодействия белка с ДНК. Прежде всего, был создан файл с определёнными наиболее удобными для данного исследования множествами: my_dna.def

Контакты атомов белка с	Полярные	Неполярные	Всего
остатками 2'-дезоксирибозы	8	32	40
остатками фосфорной кислоты	19	14	33
остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	9	9	18
остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	1	2	3

Не трудно заметить, что большая контактов - это неполярные взаимодействия белка с остатками фосфорной кислоты и остатками 2'-дезоксирибозы. Есть довольно много полярных контактов с остатками фосфорной кислоты. Названные контакты, должно быть, вносят наибольший вклад в связывание белка с ДНК.

Получение популярной схемы ДНК-белковых контактов с помощью nucplot

Для начала переводим файл .pdb в старый формат:

remediator --old 1h9t.pdb > 1h9t_old.pdb

Затем в данной папке создаём отдельную папку для выходных файлов программы nucplot и из неё запускаем программу:

nucplot ../1h9t_old.pdb

Данные, выданные программой nucplot отличаются от тех, что были получены в предыдущем задании. В данной схеме указано на порядок меньше неполярных контактов.

Возможные распознающие контакты

Опираяюсь на схему программы nucplot, могу предположить, что распознающими контактами будут взаимодействия G6, G7 на цепях ДНК X и Y соответственно с Arg35, Arg45 на цепях белка A и B, так как 4 таких взаимодействия довольно сильны и специфичны, на мой взгляд. Картинка одного из таких взаимодействий:

Характеристика ДНК-связывающего домена FadR_C

Полное название ДНК-связывающего домена: Fatty acid responsive transcription factor FadR, C-terminal.

Краткая аннотация этого домена в InterPro:

Bacteria regulate membrane fluidity by manipulating the relative levels of saturated and unsaturated fatty acids within the phospholipids of their membrane bilayers. In Escherichia coli, the transcription factor, FadR, functions as a switch that co-ordinately regulates the machinery required for fatty acid beta-oxidation and the expression of a key enzyme in fatty acid biosynthesis. This single repressor controls the transcription of the whole fad regulon [1]. Binding of fadR is specifically inhibited by long chain fatty acyl-CoA compounds.

The crystal structure of FadR reveals a two domain dimeric molecule where the N-terminal winged-helix domain binds DNA [INTERPRO:IPR000524], and the C-terminal domain binds acyl-CoA [1]. The binding of acyl-CoA to the C-terminal domain results in a conformational change that affects the DNA binding affinity of the N-terminal domain [2].

FadR is a member of the GntR family of bacterial transcription regulators. The DNA-binding domain is well conserved for this family, whereas the C-terminal effector-binding domain [INTERPRO:IPR011711] is more variable, and is consequently used to define the GntR subfamilies [3]. The FadR group is the largest subgroup, and is characterised by an all-helical C-terminal domain composed of 6 to 7 alpha helices [2]. This entry represents the C-terminal domain of FadR.