📊 Парные выравнивания: глобальное vs локальное
Таблица 1. Глобальное выравнивание (Needleman–Wunsch)
| Protein Name | ID 1 | ID 2 | Score | % Identity | % Similarity | Gaps | Indels |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EFG | EFG_ECOLI | EFG_BACSU | 2156.0 | 61.3 | 74.8 | 14 | 6 |
| FTSZ | FTSZ_ECOLI | FTSZ_BACSU | 883.0 | 47.3 | 67.4 | 9 | 6 |
| RPOB | RPOB_ECOLI | RPOB_BACSU | 3034.0 | 42.5 | 55.5 | 433 | 17 |
Таблица 2. Локальное выравнивание (Smith–Waterman)
| Protein Name | ID 1 | ID 2 | Score | % Identity | % Similarity | Gaps | Indels | Coverage 1 | Coverage 2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EFG | EFG_ECOLI | EFG_BACSU | 2158.0 | 61.6 | 74.9 | 13 | 5 | 99.4 % | 99.9 % |
| FTSZ | FTSZ_ECOLI | FTSZ_BACSU | 889.5 | 48.2 | 69.3 | 4 | 3 | 96.9 % | 97.1 % |
| RPOB | RPOB_ECOLI | RPOB_BACSU | 3039.0 | 43.7 | 57.0 | 396 | 14 | 93.1 % | 82.8 % |
📌 Комментарии к выравниваниям
1. EFG_ECOLI и EFG_BACSU
- Глобальное: идентичность 61.3%, сходство 74.8%, гэпы 14, индели 6
- Локальное: идентичность 61.6%, сходство 74.9%, гэпы 13, индели 5, покрытие ~99% у обоих
Выводы: Белки гомологичны по всей длине (покрытие ~99%). Локальное и глобальное выравнивания дают очень близкие результаты. Небольшая разница в числе гэпов и инделей (14→13, 6→5) связана с тем, что локальное выравнивание может «отбросить» несколько неконсервативных концевых участков. Информативность локального выравнивания не выше, чем глобального, так как белки глобально гомологичны.
2. FTSZ_ECOLI и FTSZ_BACSU
- Глобальное: идентичность 47.3%, сходство 67.4%, гэпы 9, индели 6
- Локальное: идентичность 48.2%, сходство 69.3%, гэпы 4, индели 3, покрытие >96%
Выводы: Белки гомологичны почти по всей длине (покрытие >96%). Локальное выравнивание даёт чуть более высокую идентичность, так как оно исключает несколько плохо выравнивающихся участков (гэпов стало меньше: 9→4). Возможно, некоторые консервативные участки, сопоставленные в локальном выравнивании, в глобальном были «раздвинуты» вставками (инделями) для сохранения общей структуры. Локальное выравнивание здесь незначительно информативнее, но глобальное тоже хорошо отражает гомологию.
3. RPOB_ECOLI и RPOB_BACSU
- Глобальное: идентичность 42.5%, сходство 55.5%, гэпы 433, индели 17
- Локальное: идентичность 43.7%, сходство 57.0%, гэпы 396, индели 14, покрытие 93% / 83%
Выводы: Белки не гомологичны по всей длине (особенно у Bacillus coverage 82.8% против 93.1% у E. coli). В них есть гомологичные участки (вероятно, консервативные домены), но большие негомологичные вставки или хвосты. Локальное выравнивание значительно информативнее глобального, так как оно не пытается принудительно сопоставлять длинные негомологичные участки, что видно по огромному числу гэпов в глобальном варианте (433 против 396). Пара букв, сопоставленных локально, но не глобально: это характерно для консервативных мотивов, которые в глобальном выравнивании были «разорваны» длинными вставками. Алгоритм Needleman–Wunsch вынужден растягивать выравнивание на всю длину, вставляя много гэпов, в то время как Smith–Waterman может выделить только общие домены.
🔎 Общий вывод:
• Для глобально гомологичных белков (EFG) оба метода дают схожий результат, и глобальное выравнивание вполне информативно.
• Для умеренно дивергировавших белков (FTSZ) локальное выравнивание чуточку лучше, но разница не критична.
• Для белков с доменной структурой и большими вставками (RPOB) локальное выравнивание значительно полезнее, так как оно выявляет функционально значимые консервативные участки и не маскирует их огромным числом гэпов.
• Для глобально гомологичных белков (EFG) оба метода дают схожий результат, и глобальное выравнивание вполне информативно.
• Для умеренно дивергировавших белков (FTSZ) локальное выравнивание чуточку лучше, но разница не критична.
• Для белков с доменной структурой и большими вставками (RPOB) локальное выравнивание значительно полезнее, так как оно выявляет функционально значимые консервативные участки и не маскирует их огромным числом гэпов.
🧬 Сравнение на неродственных белках
| Выравнивание | Score | % Identity | % Similarity | Gaps | Indels | Coverage 1 | Coverage 2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Глобальное | 18.0 | 2.7 | 4.5 | 100 | 2 | 100 % | 100 % |
| Локальное | 24.0 | 33.3 | 53.3 | 0 | 0 | 48.3 % | 16.9 % |
Комментарии к выравниваниям неродственных белков
- Глобальное: идентичность 2.7% — крайне низкое значение, не превышающее уровень случайного совпадения. Огромное количество гэпов (100) свидетельствует о том, что алгоритм вынужден вставлять пропуски практически на каждом шаге. Такой результат биологически бессмысленен и указывает на отсутствие эволюционного родства между белками.
- Локальное: идентичность 33.3% резко выше, чем в глобальном случае. Это означает, что в последовательностях есть небольшой участок (Coverage 1 = 48.3%, Coverage 2 = 16.9%), который случайно оказался похожим. Однако такой «гомологичный» участок, скорее всего, является артефактом — например, коротким общим мотивом, который встречается во многих белках (связывание нуклеотидов, ионы металлов), но не свидетельствует о родстве. Отсутствие гэпов говорит о том, что найденный фрагмент выровнялся без вставок, но его малая длина и низкое покрытие второго белка (всего 16.9%) делают вывод о гомологии недостоверным.
- Сравнение методов: локальное выравнивание не спасает ситуацию — оно просто нашло случайно сохранившийся короткий фрагмент, который может ввести в заблуждение. Глобальное выравнивание честно показало, что белки не имеют общей структуры. Правильная интерпретация: пара является неродственной, и ни один из методов не должен использоваться для утверждения гомологии.
Итог: Для неродственных белков глобальное выравнивание даёт очень низкий процент идентичности (<5-10%) и огромное число гэпов. Локальное выравнивание может случайно найти короткий похожий участок, но его биологическая значимость должна подтверждаться дополнительными методами (доменный анализ, структура). В данном случае оба метода подтверждают отсутствие гомологии, хотя локальное выравнивание создаёт иллюзию схожести (33.3% identity), которая не является доказательством родства.
🧬 Множественное выравнивание белков
Всего с функцией EFG в Swiss Prot нашлось 882 белка. Сделаем множественное выравнивание для 7 из них: EFG_STRM5, EFG_RHILO, EFG_FRATO, EFG_BUCA5, EFG_BIFA0, EFG_BACSU, EFG_ECOLI.
Сначала был создан файл в формате .txt со списком белков. После с помощью команды seqret мы получили файл со всеми аминокислотными последовательностями этих белков в формате .fasta. Затем, с помощью команды emma -sequence proteinsEFG.fasta -outseq final.fasta мы получили файл с выравниванием и раскрасили его по проценту идентичности в Jalview.
Все белки имеют достаточно большие консервативные участки: 17-37, 88-113, 271-281 и многие другие). Несмотря на неполное сходство белковых последовательностей, можно сказать, что белки гомологичны на основании большого сходства последовательностей.
Практикум №9 — Выравнивание как отражение эволюции