Сборка генома de novo.

Чтения

На соответствующем сайте я скачала чтения (в формате fastq) проекта по секвенированию бактерии Buchnera aphidicola с данным мне кодом доступа - SRR4240359. Файл был перенесен в директорию /nfs/srv/databases/ngs/e.caterina/pr13 и там распакован:

| gunzip SRR4240359.fasrq.gz

Подготовка чтений

Для сборки генома требовалась предварительная подготовка чтений. Во-первых, необходимо было удалить остатки адапетров: их последовательности были скапированы из папки /P/y16/term3/block3/adapters в файл adapters.fa. Затем эти последовательности были удалены из ридов:

| java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240359.fastq SRR4240359_1.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7
Input Reads: 13557938 Surviving: 13502036 (99,59%) Dropped: 55902 (0,41%)

| fastqc SRR4240359.fastq

| fastqc SRR4240359_1.fastq

После этого были удалены буквы с плохим качеством и чтения, длиной менее 30 букв:

| java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240359_1.fastq SRR4240359_cl.fastq TRAILING:20 MINLEN:30
Input Reads: 13502036 Surviving: 12549379 (92,94%) Dropped: 952657 (7,06%)

| fastqc SRR4240359_cl.fastq

Сборка

Первый этап сборки - подготовка k-меров (k=29 и k=25). Она была выполнена с помощью команды velveth пакета velveth:

| velveth velveth 29 -fastq -short SRR4240359_cl.fastq
| velveth velveth 25 -fastq -short SRR4240359_cl.fastq

Затем командой velvetg была произведена сама сборка:

| velvetg velveth
Final graph has 2049 nodes and n50 of 47361, max 91528, total 723361, using 0/12549379 reads
Final graph has 10154 nodes and n50 of 2982, max 17922, total 919878, using 0/12549379 reads

Graph  LastGraph  Log  PreGraph  Roadmaps  Sequences  contigs.fa  stats.txt

Сборка половины файла

Т. к. было известно число ридов после очистки, а также то, что в формате fastq каждый рид имеет 4 строки, половина файла была получена записью первых 25098760 строк в другой файл (и было проверено, что конец файлв случайно не обрезает информацию посреди рида). Далее были проделаны все те же операции:

| head -25098760 SRR4240359_cl.fastq > SRRhalf.fastq


| tail -4 SRRhalf.fastq
@SRR4240359.6720197 6720197/1
ATTTGGTTATGCTACTAATGAAACTGAATTTTTCAT
+
IIIIIIIIIII4IIIIIIIII'IIIIIIIIIIII7I

| velveth velveth 29 -fastq -short SRRhalf.fastq

| velvetg velveth
Final graph has 672 nodes and n50 of 52117, max 111442, total 678130, using 0/6274690 reads

Анализ полученной сборки можно увидеть в таблице 3 (выше). Среднее покрытие упало примерно в 6 раз, максимальные покрытия контигов также уменьшились, строк с минимальным покрытием стало гораздо меньше (что не отражено в таблице). Почему-то увеличилась максимальная длина контигов - возможно, это как-то связано с трудностью правильного разрешения повторов при наличии только половины ридов.

Анализ

С помощью megablast (порог Evalue 0.01, длина слова 24) были получены выравнивания для трех самых длинных контигов с хромосомой Buchnera aphidicola (GenBank/EMBL AC — CP009253 - это subject, т. е. координаты на ней s.start и s.end ). В таблице 4 представлены данные по выравниваниям:

Таблица 4. Выравнивания трех самых длинных контигов

Ниже (рис. 1-3) приведены карты выравниваний. Видно, что покрытия расположены линейно, но имеют разрывы. При этом контиг 4 имеет обратную ориентацию.

Рисунок 1. NODE_4_length_91528_cov_53

Рисунок 2.NODE_3_length_83127_cov_51

Рисунок 3.NODE_1_length_78160_cov_57.46