Использование алгоритма поиска BLAST локально и через веб-интерфейс на примере контига из выбранной сборки эукариотического организма

Описание выбранного контига

В этом практикуме я продолжаю работать с сборкой генома для попугая какапо. Ee refSeq ID -- GCF_004027225.2. Был выбран скаффолд наименьшей длины, содержащий хотя бы 1 CDS. Он не помещен ни в одну из хромосом (unplaced scaffold). Его параметры:

На этом участке имеется 3 гена, среди которых 2 белок-кодирующих, причем у одного из белков 3 изоформы
Идентификатор контига NW_022651074.1
Длина: 21 488 b.p.

sorry — **Рис. 1** Структура контига. Гены показаны фиолетовым (продукт - некодирующая РНК) и зелеными (белок-кодирующие) прямоугольниками, причем более светлый оттенок соответствует нетранслируемым областям. В данном случае, гены располагаются как на "+"-, так и на "-"-цепи. Интроны показаны линиями соответствующих цветов.

Скачать файл в fasta-формате можно по ссылке.

Поиск в BLAST

Далее проводился поиск последовательностей по выбранному контигу с использованием сервиса BLAST и алгоритмами blastn, megablast, blastx, tblastx и исключением некоторых таксонов. Параметры поиска и находки приведены в таблице 1.

Заметим, что попугаи какапо эволюционно обособлены от других видов птиц, и обычно сближаются с другими новозеландскими попугаями (род Nestor) в семейство Strigopidae [1][2]. Примечание: чаще всего количество находок не изменяется, т.к. у автора есть опасение, что как минимум один из белков, кодирующихся геном из данного скэффолда -- фактор, ассоциированный с TATA-box-связывающим белком -- присутствует у большого числа организмов в выбранных таксонах, что потребовало бы увеличения размеров выборки до допустимого максимума.

Алгоритм поиска	Выбор таксонов	Длина слова	Количество находок	Таксономия находок	Состав находок	Пример использования алгоритма
blastn	Исключен сам род Strigops, поиск среди птиц	11	500/500	Различные группы птиц: представители попугаеобразных (за исключением Cacatuidae), дневных хищных птиц, воробьинообразных, гусеообразных и др., а также бескилевых.	Найдены гомологи обоих белок-кодирующих генов, однако не найден ген, кодирующий ncRNA. Помимо этого 4 выранивания создано с целыми хромосомами (в данном случае это одна из половых хромосом -- Z). Это интересное наблюдение, т.к. рассматриваемый контиг не отнесен ни к одной хромосоме в рассматриваемой сборке. Находки с самым небольшим весом по размерам и местоположению совпадают с описанными в случае применения megablast для попугаеобразных без двух родов.	Поиск среди менее схожих (относительно megablast) последовательностей. Позволяет сравнивать геномы не-близкородственных видов, в том числе определять принадлежность генома или его фрагмента к конкретному организму. Также можно искать гомологи среди генов, не кодирующих белки.
megablast (2 варианта - второй в скобках)	среди попугаев за исключением родов Strigops и Nestor (среди рода Nestor)	16 (28)	100/100 (7/100)	Psittacidae -- в результаты не включены два других семейства попугаеобразных (попугаи указанного рода)	У всех птиц найдены два участка в районе 8000 и 18 000 нуклеотидов, длиной около 200-300 b.p. Они принадлежат различным генам, в основном бета-фибриногену. При этом в оригинальном геноме такого гена нет, и найденные участки не соотносятся с границами генов в контиге. Возможно, это результат относительной эволюционной близости данных попугаев. (Хоть и фрагментарно, но найдены оба белок-кодирующих гена в контиге). Как итог, можно увидеть, насколько различается поиск среди более и менее близких видов.	Быстрый поиск среди очень похожих последовательностей -- подходит для особей того же или близкого вида. Может пригодиться для определения местоположения гена изучаемой последовательности гена
blastx	В данном случае blastx не требуется использовать, т.к. гены уже известны, а для поиска гомологов предпочтительнее использовать blastp. И все же попробуем провести поиск с целью нахождения гомологов у других организмов -- были выбраны млекопитающие.	3	100/100	Разнообразные млекпитающие	Найден один из двух белков, кодируемых генами исследуемого контига. Это трансмембранный белок 8B. Заметим, что второй белок -- фактор, ассоциированный с TATA-box-связывающим белком -- найден не был, хотя поиск с использованием белка какапо показал наличие гомологов у млекопитающих	Аннотация генов и определение CDS
tblastx	Попугаеобразные с исключением самих какапо	3	100/100	На этот раз найдены последовательности представителей всех трех семейств попугаеобразных	Повторяются результаты других поисков: найдены как гены из контига какапо, так и несвязанные с ними фрагменты -- участок гена бета-фибриногена и др. Мы предполагаем, что эти находки обусловлены эволюционной близостью попугаеобразных	Предсказание генов

Поиск гомологов рРНК в геноме эукариот на основе гена E.coli

С помощью команды sudo apt install ncbi-blast+ установлена локальная версия BLAST. Создана локальная база данных на основе генома организма командой makeblastdb -in ../GCF_004027225.2_bStrHab1.2.pri_genomic.fna -dbtype nucl.

Командами

blastn -task blastn -evalue 0.05 -query RNA1.fa -db ../GCF_004027225.2_bStrHab1.2.pri_genomic.fna -out blast_rrna1 -outfmt 7

blastn -task blastn -evalue 0.05 -query RNA2.fa -db ../GCF_004027225.2_bStrHab1.2.pri_genomic.fna -out blast_rrna2 -outfmt 7

Для выполнения этой задачи выбран blastn, т.к. проводится поиск по нуклеотидным последовательностям, а гены рРНК не белок-кодирующие. Добавлены некоторые параметры: e-value, т.к. по умолчанию оно имеет значение 10, а в веб-версии blast это же значение равно 0.05; опция -out для удобства просмотра результатов, а также опция -outfmt для получения комментариев к поиску.

16S РНК входит в состав малой субъедиинцы рибосомы, а 23S -- большой.

Для 16S RNA найден 1 гомолог (с небольшим score и большим e-value -- 0.019), для 23S -- 5 (среди них 4 имеют e-value порядка как минимум 10^(-4); у лучшей находки e-value 2e-17, но небольшой score. Она находится внутри гена с CDS, продукт - неохарактеризованный белок XP_030347041.1). При этом в таблице особенностей не указано ни одной рРНК, кроме 5S или 5.8S. Поэтому сделать вывод о случайности находок трудно -- как минимум, мы имеем дело с неполной аннотацией генома.

Имеющиеся находки, если бы они были релевантными, соответствовали бы эукариотическим гомологам 16S и 23S rRNA -- это 18S и 28S rRNA. Эукариоты имеют большое количество копий этих РНК. Также могли быть найдены митохондриальные гомологи, но в данной сборке митохондриальный геном отсутствует.

Wright TF, Schirtzinger EE, Matsumoto T, Eberhard JR, Graves GR, Sanchez JJ, Capelli S, Müller H, Scharpegge J, Chambers GK, Fleischer RC. A multilocus molecular phylogeny of the parrots (Psittaciformes): support for a Gondwanan origin during the cretaceous. Mol Biol Evol. 2008 Oct;25(10):2141-56. doi: 10.1093/molbev/msn160. Epub 2008 Jul 24. PMID: 18653733; PMCID: PMC2727385.
https://www.bird-phylogeny.de/superorders/australaves/psittacifomes/

I don't know how to make footer properly. You may as well pretend you haven't seen this phrase!