Task 5

Оценка качества 3D структуры

Поиск и объяснение странностей в указанных PDB файлах

PDB-код: 7GPB, год расшифровки: 1991, разрешение: 2,90 Å

Данная структура получена для гомотетрамера гликогенфосфорилазы B. Общий вид структуры не вызывает вопросов, однако большие сомнения возникают на счет правильности структуры Trp67, особенно в цепях D (рис. 1) и А (рис. 2).

Рис. 1. Trp67 цепи D. Рис. 2. Trp67 цепи A.

Триптофан – ароматическая аминокислота, система из двух его сопряженных колец должна быть плоской. В цепях B и C она практически является таковой, чего никак не скажешь про триптофан цепи D. Впрочем, и значения температурного фактора B (ADP, Atomic Displacement Parameter), приведенные в PDB для атомов индольного кольца Trp67 слишком высоки, в особенности варьирующие в районе 50 значения B для атомов СE3, CZ2, CZ3, CH2 бензольного кольца, выходящих из плоскости, в которой расположенны атомы пиррола. Однако можно также отметить, что значения B больше 50 почти для 20% атомов структуры.

Еще одна странность данной структуры - практически полное отсутствие информации об ее получении в поле REMARK. Кроме того нет карты электронной плотности и файла структурных файлов.

PDB-код: 5RXN, год расшифровки: 1984, разрешение: 1,20 Å

Данная структура получена для рубредоксина клостридии. В структуре имеется D-изомер треонина - Thr5. Изолейцин и треонин – аминокислоты, имеющие по два хиральных атома углерода. То есть, изолейцин и треонин могут существовать в виде четырех стереоизомеров. Практически все аминокислоты в природе - L-стереоизомеры (2S,3R), каковыми являются и треонины 7 и 28 белка. Thr28 представлен на рис. 4 в качестве примера. Однако треонин 5 (рис.3) представлен в структуре как D-стереоизомер, что очень маловероятно. При этом электронная плотность Thr5 размыта, определена гораздо хуже, а температурные факторы получены выше, чем для остальных треонинов структуры, поэтому можно смело сказать, что его структура неверно разрешена.

Рис. 3. Thr5, D-изомер. Рис. 4. Thr28, L-изомер.

PDB-код: 1GT0, год расшифровки: 2003, разрешение: 2,60 Å

Данная структура получена для POU/HMG/DNA комплекса. В структуре в цепи С (домен POU) пропущены с 78-го по 96-й остатки включительно (отсутствуют в PDB) (рис.5). Скорее всего эти остатки принадлежат некому подвижному элементу - петле.

Рис. 5. POU/HMG/DNA комплекс. Указаны остатки, ограничиваюшие разрыв в PDB-структуре.

Стоит отметить также, что температурные факторы остатков, расположенных по границам разрыва очень высоки, поэтому, вероятно, они также входят в состав подвижного элемента, и их координаты определены не точно. Если подгрузить карту электронной плотности, то можно увидеть что и распределение их электронной плотности (рис. 6) не дает возможности точно определить их положение. Также можно заметить некую электронную плотность в области некоторых пропущенных остатков (рис. 6).

Рис. 6. POU домен.Указаны остатки, ограничиваюшие разрыв в PDB-структуре. Представлено распределение электронной плотности для остатков 76-98. Серым изображена поверхность с уровнем подрезки 1, черным - 2.

Сложности с определением координат для очень подвижных, расположенных на поверхности белка структурных элементов, например, мобильных петель, изменяющих конформацию при катализе - распространенное явление. В разных ячейках кристалла подвижный элемент имеет разные положения, поэтому нельзя определить точные координаты его атомов - электронные плотности гасят друг друга.

При поиске странностей в выше описанных PDB структурах обращалось внимание и на коэффициент заполнения, однако ни в одной из них не было атома с коэффицентом не равным одному (за исключением молекул воды в 5RXN).

Сравнение числа атомов с коэффициентом заполнения менее 1 и значений температурных факторов

В качестве кристаллографической структуры среднего разрешения (2,0 - 2,5 Å) была взята структура 2013 года апоформы лактатдегидрогеназы человека 4L4R c разрешением 2,10 Å. Для выбора структуры атомного разрешения (<1,0 Å) использован advanced search в PDB, в результате которого выбрана структура 2002 года глюкозоизомеразы человека 1MNZ с разрешением 0,99 Å.

Структура среднего разрешения 4L4R

Структура представлена цепями А и H. При этом странно, что в цепи А нет атомов с коэффициентами заполнения меньше единицы (кроме одного атома глутамина), в то время как в H для трех остатков указано по две возможных конформации (табл. 1). Более того в структуре субъединицы лактатдегидрогеназы имеется мобильная петля 96-111, закрывающаяся после связывания кофактора и субстрата. В апоформе она открыта, однако должна быть очень подвижна. Получить структуру апоформы фермента впринципе очень сложно, все предыдущие структуры лактатдегидрогеназы содержали кофермент и ингибитор или просто ингибитор. И даже в случаях когда с петлей взаимодействовал ингибитор, координаты ее атомов зачастую были не определены. При этом многие из атомов остатков 96-111 структуры имеют температурные факторы больше 40 - даже больше 100. Плюс странно, что во всей структуре температурные факторы имеют довольно высокое среднее значение около 40.

Впринципе температурный фактор характеризует меру динамической неупорядоченности кристалла, обусловленной тепловым движением. Температурные факторы в структурах с плохим разрешением при этом не имеют особого смысла - электронная плотность видна только вокруг целых остатков, а отдельные атомы неразличимы. С повышением температуры неупорядоченность повышается, чем меньше температурный фактор, тем точнее определены координаты атома - меньше тепловое колебание атомов.

Оптимальными обычно считают значения температурных факторов до 30, однако в данной структуре только около 10% атомов соответствуют такие значения. При скачивании же Conservatively optimised structure с PDB_REDO было замечено уменьшение температурных факторов в среднем где-то в полтора раза.

Атомы с коэффицентами заполнения меньше единицы представлены в табл. 1. Имеется два атома с нулевыми коэффициентами. Также, как видно в таблице, в структуре имеется только одна молекула воды с таким коэффициентом (0,5). Температурный фактор для данной молекулы воды довольно высок, однако, при этом еще около половины молекул воды структуры имеет схожие значения, но все они имеют коэфиценты заполнения 1,0.

Кроме того в цепи Н структуры имеются 3 остатка с альтернативными конформациями (табл. 1). Впринципе, можно сказать, что для конформации с большей вероятностью значения температурного фактора в среднем ниже, но разница невелика. Для остатка 72 первыми в PDB файле почему-то записаны координаты конформации с меньшей вероятностью.

Табл. 1. Атомы структуры 4L4R с коэффициентом заполнения менее 1.

Также в PDB файле дополнительно представлены ANISOU с анизотропными температурными факторами.

Структура атомного разрешения 1MNZ

Структура представлена одной субъединицей. В данной структуре среднее значение температурного фактора находится в районе 15, что гораздо лучше, чем в случае структуры 4L4R.

Атомы с коэффицентами заполнения меньше единицы представлены в табл. 2. Имеется пара десятков молекул воды с таким коэффициентом (для большинства он все же больше 0,5). При этом температурные факторы их атомов находятся около среднего значениия, а среди атомов с единичным коэффицентом заполнения встречается много с фактором больше 30.

Кроме того имеются 2 остатка с альтернативными конформациями атомов (табл. 2). Но для конформации с большей вероятностью значения температурного фактора выше, однако разница опять невелика.

Табл. 2. Атомы структуры 1MNZ с коэффициентом заполнения менее 1.

В PDB файле, как и в случае первой структуры, представлены ANISOU с анизотропными температурными факторами.

Можно также добавить, что для глюкозоизомеразы человека имеется альтернативная структура 1994 года 1XIB с разрешением 1,60 Å. Среднее знаечние температурного фактора в ней приблизительно такое же. Однако в ней имеется только пара молекул воды с коэффициентом заполнения 0,5 и только для NZ атомов лизина 253 указаны альтернативные конформации с коэффициентами 0,5.