Мембранные белки

1. Построение парного выравнивания исследуемого белка и заданного прототипа

С помощью SRS в БД Uniprot по AC P04191 была найдена последовательность кальциевой АТФазы. В базе данных PDB была найдена последовательность этого же белка (pdb-код 1SU4), для которой приведены результаты рентгеноструктурного анализа. Эти последовательности не идентичны, как и предполагалось. Выравнивание приведено здесь
Процент идентичности - 99.2%. Как видно из выравнивания, последовательности отличаются лишь тем, что та, что дана в PDB, короче на 7 аминокислотных остатков (возможно, "хвост" оторвался в процессе экстракции белка), а также различаются 994й с начала аминокислотный остаток.
В БД Uniprot получила последовательность изучаемого белка - Q7ZXY6_XENLA (кальциевая АТФ-аза африканской когтистой лягушки Xenopus laevis).
Выравнивание было сделано с помощью программы needle со стандартными параметрами (штраф за открытие гэпа - 10, штраф за продолжение гэпа - 0,5). 89.3% - довольно большой процент сходства. Да и сами последовательности различаются по длине всего на 2 аминокислотных остатка.
Готовое выравнивание импортировала в GeneDoc и сохранила в файле под названием marking.msf

2,3. Разметка мембранных сегментов на выравнивании и предсказание топологии заданного белка с помощью программы TMHMM

В БД OPM (Orientations of Proteins in Membranes database) по pdb-коду белка-прототипа (1SU4) нашла описание ориентации белка в мембране . Он является трансмембраным белком, в его структуру входит альфа-спираль, относится к суперсемейству фосфорных АТФаз и семейству кальциевых АТФаз.

Данной программе на вход была подана последовательность моего белка в fasta-формате. Программа выдала следующий вариант локализации белка в мембране:

К выравниванию в файле marking.msf было добавлено еще 2 последовательности. Последовательность OPM представляет является предсказанием локализации моего белка в мембране по данным белка-прототипа, то есть описывает участки последовательности, находящиеся в мембране (мембранные сегменты показаны буквой H), цитоплазме (знаки +), или снаружи мембраны (знаки -). Последовательность TMHMM для изучаемого мною белка создана по данным сервера TMHMM. (опции по умолчанию) Участки белковой последовательности различной локализации указаны по тому же принципу, что и в последовательности OPM.

Ниже приведено выравнивание и последовательности OPM и TMHMM.

* 2 0 * 4 0 * 6 0 * 8 0

1 S U 4 : M E A A H S K S T E E C L A Y F G V S E T T G L T P D Q V K R H L E K Y G H N E L P A E E G K S L W E L V I E Q F E D L L V R I L L L A A C I S F V L A W F E E G : 8 1

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : M E N A H A K T T E E C L A Y F G V N E N T G L S P E I V K K N F E K Y G P N E L P A E E G K S I W E L V A E Q F E D L L V R I L L L A A C I S F V L A W F E E G : 8 1

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - : 2 0

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - : 1 9

* 1 0 0 * 1 2 0 * 1 4 0 * 1 6 0

1 S U 4 : E E T I T A F V E P F V I L L I L I A N A I V G V W Q E R N A E N A I E A L K E Y E P E M G K V Y R A D R K S V Q R I K A R D I V P G D I V E V A V G D K V P A D : 1 6 2

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : E E T V T A F V E P F V I L L I L I A N A V V G V W Q E R N A E D A I E A L K E Y E P E M G K V Y R S D R K S V Q R I K A R E I V P G D I V E V A V G D K V P A D : 1 6 2

O P M : - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : 3 9

T M H M M : - - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : 3 9

* 1 8 0 * 2 0 0 * 2 2 0 * 2 4 0

1 S U 4 : I R I L S I K S T T L R V D Q S I L T G E S V S V I K H T E P V P D P R A V N Q D K K N M L F S G T N I A A G K A L G I V A T T G V S T E I G K I R D Q M A A T E : 2 4 3

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : I R L I S I K S T T L R I D Q S I L T G E S V S V I K H T E V V P D P R A V N Q D K K N M L F S G T N V G A G K A I G V V I A T G P N T E I G K I R D E M A A T E : 2 4 3

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 2 6 0 * 2 8 0 * 3 0 0 * 3 2 0

1 S U 4 : Q D K T P L Q Q K L D E F G E Q L S K V I S L I C V A V W L I N I G H F N D P V H G G S W I R G A I Y Y F K I A V A L A V A A I P E G L P A V I T T C L A L G T R : 3 2 4

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : Q D K T P L Q Q K L D E F G E Q L S K V I S L I C V A V W L I N I G H F N D P I H G G S W I K G A V Y Y F K I A V A L A V A A I P E G L P A V I T T C L A L G T R : 3 2 4

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + + + + + + + + + + : 7 3

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + : 8 2

h

* 3 4 0 * 3 6 0 * 3 8 0 * 4 0 0

1 S U 4 : R M A K K N A I V R S L P S V E T L G C T S V I C S D K T G T L T T N Q M S V C K M F I I D K V D G D F C S L N E F S I T G S T Y A P E G E V L K N D K P I R S G : 4 0 5

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : R M A K K N A I V R S L P S V E T L G C T S V I C S D K T G T L T T N Q M S V C R M F V L D K V D G D I C S L N E F S I T G S T Y A P E G E V L K N D K T V K A G : 4 0 5

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 4 2 0 * 4 4 0 * 4 6 0 * 4 8 0

1 S U 4 : Q F D G L V E L A T I C A L C N D S S L D F N E T K G V Y E K V G E A T E T A L T T L V E K M N V F N T E V R N L S K V E R A N A C N S V I R Q L M K K E F T L E : 4 8 6

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : Q Y D G L V E L A T I C A L C N D S S L D F N E S K G V F E K V G E A T E T A L T T L V E K M N V F N T D V R S L S K V E R A N A C N S V I K Q L M K K E F T M E : 4 8 6

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 5 0 0 * 5 2 0 * 5 4 0 * 5 6 0

1 S U 4 : F S R D R K S M S V Y C S P A K S S R A A V G N K M F V K G A P E G V I D R C N Y V R V G T T R V P M T G P V K E K I L S V I K E W G T G R D T L R C L A L A T R : 5 6 7

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : F S R D R K S M S V Y C T P A K A S R A A V G N K M F V K G A P E G V I D R C N Y V R V G T T R V P L T S A I K D T I L T V I K E W G T G R D T L R C L A L A T R : 5 6 7

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 5 8 0 * 6 0 0 * 6 2 0 * 6 4 0

1 S U 4 : D T P P K R E E M V L D D S S R F M E Y E T D L T F V G V V G M L D P P R K E V M G S I Q L C R D A G I R V I M I T G D N K G T A I A I C R R I G I F G E N E E V : 6 4 8

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : D T P P K R E D M V L E D S T K F V D Y E T D L T F V G C V G M L D P P R K E V M G S I K L C R E A G I R V I M I T G D N K G T A I A I C R R I G I F G E N D D V : 6 4 8

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 6 6 0 * 6 8 0 * 7 0 0 * 7 2 0

1 S U 4 : A D R A Y T G R E F D D L P L A E Q R E A C R R A C C F A R V E P S H K S K I V E Y L Q S Y D E I T A M T G D G V N D A P A L K K A E I G I A M G S G T A V A K T : 7 2 9

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : S R L A F T G R E F D D L P P A E Q R E A C K R A S C F A R V E P S H K S K I V E F L Q S F D E I T A M T G D G V N D A P A L K K A E I G I A M G S G T A V A K T : 7 2 9

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : -

* 7 4 0 * 7 6 0 * 7 8 0 * 8 0 0 *

1 S U 4 : A S E M V L A D D N F S T I V A A V E E G R A I Y N N M K Q F I R Y L I S S N V G E V V C I F L T A A L G L P E A L I P V Q L L W V N L V T D G L P A T A L G F N : 8 1 0

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : A S E M V L A D D N F S T I V A A V E E G R A I Y N N M K Q F I R Y L I S S N V G E V V C I F L T A A L G L P E A L I P V Q L L W V N L V T D G L P A T A L G F N : 8 1 0

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + : 1 1 1

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - : 1 0 5

8 2 0 * 8 4 0 * 8 6 0 * 8 8 0 *

1 S U 4 : P P D L D I M D R P P R S P K E P L I S G W L F F R Y M A I G G Y V G A A T V G A A A W W F M Y A E D G P G V T Y H Q L T H F M Q C T E D H P H F E G L D C E I F : 8 9 1

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : P P D L D I M D R A P R S P K E P L I S G W L F F R Y L A I G A Y V G A A T V G A A A W W F M Y A D D G P E V T F Y Q L S H F M Q C T E E N V E F E G L E C E I F : 8 9 1

O P M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - : 1 3 1

T M H M M : - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + : 1 2 8

H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

9 0 0 * 9 2 0 * 9 4 0 * 9 6 0 *

1 S U 4 : E A P E P M T M A L S V L V T I E M C N A L N S L S E N Q S L M R M P P W V N I W L L G S I C L S M S L H F L I L Y V D P L P M I F K L K A L D L T Q W L M V L K : 9 7 2

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : E S P V P M T M A L S V L V T I E M C N A L N S L S E N Q S L I R M P P W V N F W L L G S I C L S M S L H F L I L Y V D P L P M I F K L T P L D L T K W L V V L K : 9 7 2

O P M : - - - - - H H H H H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - - - - H H H H H H H : 1 7 6

T M H M M : + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H - - - - - - - - - - - - - - H H H H H H H H : 1 5 9

H

9 8 0 *

1 S U 4 : I S L P V I G L D E I L K F I A R N Y L E G - - : 9 9 4

Q 7 Z X Y 6 _ X E N : I S I P V I L L D E L L K F V A R N Y L E E K K : 9 9 6

O P M : H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + : 1 9 1

T M H M M : H H H H H H H H H H H H H H H + + + + + + + + + : 1 7 4

Выравнивание также сохранено в формате clustal.

4. Оценка качества предсказания

Результаты предсказания топологии мембранного белка - кальциевой АТФазы (БД Uniprot по AC P04191 )

Число а.к. остатков

Всего а.к. остатков 996

Остатки, предсказанные как локализованные в мембране (всего) 174

Правильно предсказали (true positives, TP) 81

Предсказали не то, что нужно (а.о. предсказаны как мембранные, а по данным ОРМ таковыми не являются, false positives, FP) 38

Правильно не предсказали ( не предсказаны, и по данным ОРМ не находятся в мембране, true negatives, TN) 767

Не предсказали то, что нужно (остатки по данным ОРМ находятся в мембране, false negatives, FN) 55

Чувствительность (sensivity) = TP / (TP+FN) 0,595

Специфичность (specificity) = TN / (TN+FP) 0,952

Точность (precision) = TP / (TP+FP)                        0,680

Сверхпредсказание = FP/ (FP+TP)      0,319

Недопредсказание = FN / (TN+FN)                                            0,067

Топология моего белка была предсказана с точностью 68%, что является средним показателем. Я бы сказала, что он далек от идеала, но приемлем.
Сверхпредсказание - 31,9%. На мой взгляд, в данном случае алгоритм программы явился далеко не идеальным для решения проблемы топологии данного мембранного белка. В идеальном варианте сверхпредсказание должно, конечно, равняться нулю.
Недопредсказание составило 6,7%. Достаточно значимый процент получился потому, что TMHMM пропустила 2 трансмембранных участка. Чувствительность - это доля правильно предсказанных остатков, среди тех, что на самом деле расположены в трансмембранных сегментах. В данном случае она составила 59,5%. Это низкий показатель. По выравниванию видно, что это результат того, что программой не было обнаружено 2 трансмембранных сегмента. А вот 95,2% специфичности - пожалуй, единственное реально хорошее значение в данном примере. Это означает, что лишнее TMHMM предсказывает редко. Как видно по выравниванию, в основном, это вариант, когда трансмембранные участки предсказываются длинее на несколько остатков, чем есть на самом деле (по данным OPM).