|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Для работы мне был дан белок Fas, участвующий в процессах развития злокачественных опухолей. Этот белок, связываясь с рецепторами, расположенными в лимфоцитах, запускает в них апоптоз. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Вот подборка из семи статей, относящихся к данной теме. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
В следующей статье, называющейся Identification of Amino Acid Residues Important
for Ligand Binding to Fas, были определены аминокислоты, ответственные за связывание рецептора Fas, запускающего апоптоз, с лигандом FasL. Прежде всего было выявлено сходство Fas с белками группы TNFR. Их последовательности оказались достаточно похожими, чтобы заявить и о схожести их пространственных структур. Дальнейшая работа базировалась на составленной по типу TNFR структуре Fas. Во внеклеточных доменах белка было выявлено восемь остатков, способных повлиять на связывание лиганда. Определение этих остатков дополнительно подкреплялось данными о мышином Fas. Были специально сконструированы растворимые версии Fas и FasL: человеческий ген FasL был "сращён" с крысиным CD8, согласно методике создания растворимого белка CD40 из того же семейства, что и Fas; и был создан белок FasthrRγ1, являющийся комбинацией человеческого иммуноглобулина и Fas. Необходимое количество этих белков было добыто при помощи ПЦР и последующего отбора бактерий с перенесёнными плазмидами, а после концентрация приготовленного раствора FasthrRγ1 была проверена при помощи теста ELISA на человеческий иммуноглобулин. После было отобрано 8 аминокислотных остатков во внеклеточном домене Fas, которые подверглись мутагенезу – замене на серин. Мутантные растворимые версии Fas добывались в необходимом количестве так же, как и FasthrRγ1. Каждый вектор с мутантной ДНК был секвенирован для проверки правильности проведённых мутаций. Для модели апоптоза были отобраны Юркатовы клетки (Т-лимфоциты), как особо чувствительные к механизму апоптоза, связанному с Fas. Эти клетки были помещены в кюветы с одинаковым содержанием FasL-CD80, но различными концентрациями FasthrRγ1, мутантного или же дикого типа. Для определения количества выживших клеток применялся набор Alamar blue, реагирующий на такие показатели жизнедеятельности клеток, как ATP, NADH и клеточные протеазы. В ходе работы было определено, что крысиный Fas и человечий имеют одинаковые механизмы связывания со своими лигандами, что делает дальнейшее исследование крысиного Fas приложимым к области человеческой молекулярной биологии. Также были обнаружены два остатка в D2-домене, критически необходимых для связывания: R86 and R87. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||