Мне достались записи 6J64 и 4ZKL. Обе — кристаллические структуры человеческого белка HINT1 (histidine triad nucleotide-binding protein 1, аденозин-5'-монофосфорамидаза). 6J64 — мутант H114A в комплексе с бис(аденозин)-5'-тетрафосфатом (Ap4A) и таурином, 2 цепи в асимметрической единице. 4ZKL — дикий тип в комплексе с JB419 (аналог Ap4A) и AMP, 4 цепи в асимметрической единице.
Различия, бросающиеся в глаза. В 4ZKL вдвое больше цепей (два димера вместо одного). Наборы лигандов разные: в 6J64 это Ap4A (B4P) и таурин, в 4ZKL — JB419 (JB6) и AMP; в 6J64 также есть инженерная замена H114A. Эти различия относятся к составу образца, а не к качеству моделей. У обеих структур не разрешено по несколько N-концевых остатков (в 6J64 цепи начинаются с остатков 12 и 14, в 4ZKL — с 13–15). Складывание самих цепей практически одинаково: RMSD по Cα после суперпозиции ≈ 0,23 Å.
Электронная плотность. Я сравнила карты 2mFo–DFc обеих структур в одном и том же регионе (цепь A, остатки 60–70), отображая плотность только вокруг остова (выделение backbone), на одном и том же уровне подрезки 1,0 и с одинаковым carve = 2.0; виды совмещены по Cα цепей A.
Выводы. В 6J64 плотность отлично согласуется с положениями отдельных атомов: каждый атом остова сидит в собственном максимуме плотности, карбонильные кислороды отчётливо «выпирают». В 4ZKL на том же уровне подрезки заметные участки остова вообще не покрыты плотностью, а там, где она есть, она лишь тянется «трубкой» вдоль цепи. Это говорит о том, что экспериментальные данные 6J64 несут атомарную информацию, а 4ZKL — нет. По виду карт я ожидала, что 6J64 имеет значительно лучшее разрешение.
| Признак | 6J64 | 4ZKL |
|---|---|---|
| Разрешение, Å | 0,95 | 2,34 |
| Rwork | 0,166 | 0,189 |
| Rfree | 0,175 | 0,239 |
| Число цепей | 2 | 4 |
| Лиганды | Ap4A, таурин | JB419, AMP |
Выводы полностью совпали с данными PDB: разрешение 6J64 — 0,95 Å (субатомное!), а 4ZKL — 2,34 Å. R-факторы также лучше у 6J64.
# Основные команды (задание 1) fetch 6J64 / fetch 4ZKL # или load скачанных файлов # карты: https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry-files/download/6j64.ccp4 align 4ZKL & chain A & name CA, 6J64 & chain A & name CA isomesh msh, map_6j64, 1.0, (chain A and backbone and resi 60-70), carve=2.0
4QL8 — лиганд-связывающий домен человеческого андрогенного рецептора (ост. 671–917) в комплексе с лигандом (JAD), разрешение 2,1 Å. Домен почти полностью α-спиральный. Я построила mesh вокруг остова всей цепи (carve = 2.0, чтобы не было плотности от соседей по ячейке и от боковых радикалов) на уровнях подрезки 1, 2 и 3.
Наблюдения. При переходе 1 → 2 → 3 первыми плотность теряют петли, торчащие из глобулы, и концевые участки цепи (например, вытянутый N-концевой «хвост» слева вверху на рис. 6–8 и петли по периферии). Дольше всего плотность держится на α-спиралях, упакованных в гидрофобное ядро домена. Тенденция очевидна: чем лучше участок взаимодействует с остальным белком (чем плотнее упакован и менее подвижен), тем выше и резче его электронная плотность; поверхностные петли подвижны, их плотность размазана и исчезает при повышении порога первой. Отдельно заметно, что на самых высоких уровнях подрезки плотность удерживается возле атомов кислорода и азота остова — у них больше электронов, чем у углерода.
# Основные команды (задание 2) isomesh m1, map_4ql8, 1.0, (backbone), carve=2.0 isomesh m2, map_4ql8, 2.0, (backbone), carve=2.0 isomesh m3, map_4ql8, 3.0, (backbone), carve=2.0
7KR0 — макродомен NSP3 SARS-CoV-2, субатомное разрешение 0,77 Å, поэтому альтернативные конформации (альт-локи) разрешены у многих остатков. По ведомости мне достался остаток X = GLU114 (цепь A), альт-локи A (населённость 0,55) и B (0,45). В качестве второго остатка пары я взяла Y = LYS110 — ближайший к GLU114 остаток, тоже имеющий альт-локи (A = 0,60, B = 0,40): его концевой Nζ находится всего в ~2 Å от карбоксила глутамата, то есть это потенциальный ионный партнёр.
Проверим все четыре сочетания геометрически (минимальные расстояния между тяжёлыми атомами боковых цепей):
| Сочетание | Мин. расстояние, Å | Атомы | Оценка |
|---|---|---|---|
| 114A + 110A | 3,26 | OE2…NZ | ионная водородная связь |
| 114A + 110B | 2,74 | OE2…NZ | короткая (сильная) водородная связь |
| 114B + 110A | 4,97 | OE1…NZ | контакта нет |
| 114B + 110B | 5,52 | OE1…NZ | контакта нет |
Ответы на вопросы. Строго говоря, невозможного сочетания здесь нет: ни одна из четырёх комбинаций не даёт стерического клэша (все минимальные расстояния ≥ 2,7 Å). Но сочетания различаются по стабильности. Альт-лок A остатка GLU114 образует ионную водородную связь с Nζ лизина в обоих положениях LYS110 (3,26 Å с 110A и 2,74 Å с 110B), поэтому сочетания 114A+110A и 114A+110B равноправны и оба стабилизированы. Альт-лок B глутамата разворачивает карбоксил в противоположную сторону, и контакт с лизином теряется в любом случае: сочетания 114B+110A и 114B+110B ничем не скреплены, то есть если рассматривать только пару GLU114–LYS110, они энергетически невыгодны и маловероятны.
Что же тогда стабилизирует альт-лок B глутамата (его населённость немаленькая, 0,45)? Оказывается, у GLU114 есть второй, более строгий «партнёр по корреляции» — молекула воды HOH364, у которой тоже два положения с населённостями 0,57/0,43, практически совпадающими с населённостями GLU114 (0,55/0,45). Положение HOH364_A накладывается на карбоксил GLU114_B (0,1 Å!), а HOH364_B — на карбоксил GLU114_A (0,5 Å): сочетания 114B + HOH364_A и 114A + HOH364_B невозможны. Кроме того, в конформации B карбоксил GLU114 образует водородную связь с ND2 остатка ASN117 (2,87 Å) и окружён молекулами воды (HOH218, 257, 295, 376, 392 на 2,7–3,1 Å). Таким образом, альт-локы GLU114 жёстко связаны с положением молекулы воды: A с A, B с B.
Итог: для пары GLU114–LYS110 все четыре сочетания стерически допустимы, но стабилизированы только 114A+110A и 114A+110B (ионная H-связь); наиболее стабильным кажется 114A+110B (самый короткий контакт, 2,74 Å), что согласуется с чуть большей населённостью положений A у LYS110. Одновременно GLU114 участвует в жёсткой корреляции с молекулой воды HOH364, где невозможные сочетания действительно есть.
# Основные команды (задание 3) select glu114_A, resi 114 and alt "A" select lys110_B, resi 110 and alt "B" create cAB, m & ((resi 114 and (alt A or alt "")) or (resi 110 and (alt B or alt ""))) distance hb, cAB and resi 114 and name OE2, cAB and resi 110 and name NZ
Величина B-фактора отражает степень «размытия» электронной плотности атома, то есть неопределённость его положения: чем подвижнее атом (термическая подвижность, статическое разупорядочение в кристалле), тем больше B-фактор. На рис. 15 показан остов 7KR0, окрашенный командой spectrum b, blue_white_red, backbone.
Связь с положением в глобуле есть: самые «горячие» участки — концы цепи (N-конец слева и C-конец внизу) и выступающие поверхностные петли, а ядро глобулы равномерно синее. Упакованные участки остова жёстко зафиксированы контактами, а свободно болтающиеся концы и петли подвижны.
spectrum b, blue_white_red по всем атомам.При окраске с учётом всех атомов видно характерный градиент вдоль длинных поверхностных боковых цепей. Я выбрала LYS29: B-фактор растёт от Cβ (≈ 13) к концевому Nζ (≈ 22), цепочка на рис. 17 заметно краснеет к окончаниям (у лизина два альт-лока, A = 0,53 и B = 0,47, оба направлены в растворитель). Это значит, что конец радикала сильно подвижен и его положение определено лишь приблизительно.
Подключим электронную плотность (уровни подрезки 1, 2, 3):
Связь наблюдений. Чем выше B-фактор атома, тем сильнее размазан его «колокол» электронной плотности и тем ниже его максимум. Поэтому атомы с низким B-фактором (основание радикала) покрыты плотностью даже на уровне 3, а атомы с высоким B-фактором (концевые Nζ) теряют плотность уже на уровне 1–2: сигнал от них размазан по большому объёму и не достигает порога подрезки. B-фактор и электронная плотность описывают одно и то же явление — подвижность/неопределённость положения атома — с двух сторон.
# Основные команды (задание 4) show sticks, backbone spectrum b, blue_white_red, backbone spectrum b, blue_white_red # по всем атомам isomesh m1, map_7kr0, 1.0, (resi 29), carve=1.8