BLAST

На данной странице представлен практикум по использованию программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и его веб-интерфейса на сайте NCBI.

1) Поиск гомологов белка из практикума 8

Для поиска гомологов субъединицы C цитохрома фотосинтетического реакционного центра пурпурной бактерии Blastochloris viridis из практикума 8 был запущен алгоритм BLAST со следующими параметрами:

В результате алгоритм выдал 5 последовательностей (не включая ту, по которой проводился поиск) белков из: Allochromatium vinosum DSM 180; Rubrivivax gelatinosus IL144; Thermochromatium tepidum; Roseobacter denitrificans OCh 114; Chloroflexus aurantiacus J-10-fl. Все белки выполняют роль цитохрома в электрон-транспортной цепи фотосинтетических комплексов данных бактерий. С текстовым результатом работы программы можно ознакомиться по ссылке. Найденные последовательности были загружены в формате fasta и выровнены с помощью команды:

Далее файл с выравниванием был загружен в программу Jalview, где последовательности были покрашены по проценту идентичности. Результат можно увидеть на рисунке 1, а также в файле по ссылке.

В выравнивании обнаруживается 4 (145-172; 191-220; 315-332; 413-434) относительно консервативных участка, вероятно, участвующих в связывании 4 гемов или других участников электрон-транспортной цепи цитохрома. Выделяющейся является последовательность цитохрома из Chloroflexus aurantiacus, в выравнивании которой присутствует большое количество инделей, что, возможно, свидетельствует об отсутствии гомологии с остальными белками, но точный вывод об этом сделать невозможно, так как C. aurantiacus является единственным представителем типа Chloroflexi, тогда как остальные бактерии относятся к типу Proteobacteria. Общий предок между этими типами был настолько давно, что узучаемые последовательности вполне могли так сильно измениться.

2) Поиск гомологов зрелого вирусного белка, вырезанного из полипротеина

Поиск гомологов зрелого вирусного белка проводился для полипротеина из коронавируса SARS-CoV-2. В данном вирусе обнаруживается один полипротеин, состоящий из 10 незрелых белков, 9 из которых не входят в зрелую вирусную частицу (неструктурные вирусные белки - non-structural protein(nsp)), а выполняют функции репликации РНК в клетке хозяина; созревания, упаковки и выхода вириона из клетки. Для анализа был выбран non-structural protein 8 (nsp8), который выполняет функцию праймазы в комплексе с nsp7, образуя шестнадцатисубъединичный комплекс (по 8 субъединиц nsp7 и nsp8). Информация о координатах белка в полипротеине была получена со страницы Uniprot: начало - 3943 а/к, конец - 4140 а/к. Далее для получения последовательности зрелого белка была выполнена следующая команда:

Последовательность зрелого nsp8 в fasta формате доступна по ссылке. Для поиска гомологов данной последовательности был запущен алгоритм blast с теми же параметрами, что и в пункте 1 данного практикума. На выход алгоритм выдал 58 последовательностей белков из различных вирусов. С текстовым результатом работы программы можно ознакомиться по ссылке. Для анализа были выбраны 6 вирусных последовательностей из: Human coronavirus NL63; Porcine epidemic diarrhea virus CV777; Murine hepatitis virus strain 2; Betacoronavirus England 1; Bat SARS CoV Rp3/2004; Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus. Последовательности их полипротеинов были загружены в fasta формате и объединены с изучаемым nsp8, после чего выровнены с помощью команды:

Далее файл с выравниванием был загружен в программу Jalview, где последовательности были покрашены по проценту идентичности, а также обрезаны по последовательности nsp8. Результат можно увидеть на рисунке 2, а также в файле по ссылке.

В выравнивании довольно высокий процент идентичности и мало инделей, что свидетельствует о том, что между всеми последовательностями в данном выравнивании прослеживается гомология, что соответствует ожиданиям, т.к. все изучаемые последовательности относятся к семейству Coronaviridae.

3) Исследование зависимости E-value от объёма банка

Для оценки доли вирусных белков в базе данных Swiss-Prot был запущен алгоритм blast с теми же параметрами, что и в пункте 2 данного практикума, но с применением фильтра на вирусные белки. Так как E-value прямопропорционален размеру базы данных, в которой идет поиск, по изменению его значения можно сделать вывод о проценте вирусных белков. Для анализа были выбраны 5 последовательностей, изменение E-value было следующим: 6e-130 → 3e-131; 2e-129 → 7e-131; 3e-127 → 1e-128; 1e-124 → 5e-126; 2e-63 → 8e-65. Это говорит о том, что средняя доля вирусных белков в базе данных Swiss-Prot составляет 4,16%.