Секвенирование по Сэнгеру

На данной странице представлен практикум по созданию и анализу файлов с последовательностями ДНК, полученных на основании работы с хроматограммами из капиллярного секвенатора.

1) Получение последовательностей ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора. Отчёт о проблемах при чтении хроматограмм

Для анализа качества хроматорграмм, полученных капиллярным секвенатором, и создания консенсусной последовательности, были загружены файлы прямого и обратного прочтений.

Параметры хроматограммы:

Параметры прямой хроматограммы (32_F.ab1):

• Длина прочтения: 376 нуклеотидов
• GC-состав: 58.24%
• Визуально определенный нечитаемый участок: 1-16 со стороны 5'-конца; 374-376 со стороны 3'-конца
• Уровень шума примерно 10%

Параметры обратной хроматограммы (32_R.ab1):

• Длина прочтения: 386 нуклеотидов
• GC-состав: 58.55%
• Визуально определенный нечитаемый участок: 1-24 со стороны 5'-конца; 382-386 со стороны 3'-конца
• Уровень шума примерно 10%

Сборка консенсуса:

Для создания первичного консенсуса был использован инструмент выравнивания прочтений на референсную последовательность в программе Ugene. В качестве референса была взята одна из последовательностей (32_F.ab1), относительно которой были выровнены изучаемые прочтения. Полученный консенсус считаю первичным, он был выгружен и использован в качестве референсной последовательности в следующем выравнивании с теми же ридами. Полученный контиг (без корректировки) можно загрузить в формате fasta по ссылке, а также увидеть на рисунке 1; консенсус данного выравнивания считаю вторичным, его можно загрузить по ссылке.
Общая длина выравнивания: 409 нуклеотидов; длина перекрывающегося участка: 300 нуклеотидов. При создании контига Ugene автоматически обрезает нечитаемые концы:

• Для 32_F.ab1 20 нуклеотидов c 5'-конца и 1 с 3'-конца;
• Для 32_R.ab1 27 нуклеотидов c 5'-конца и 1 с 3'-конца

Несмотря на то, что автоматическое определение нечитаемых концевых участков прочтений более сторго, т.е. обрезает большие фрагменты, в сравнении с визуальной оценкой, различия у этих 2 методов в данном случае суммарно меньше 10 нуклеотидов, что не является критичным для аннотации ридов.

Далее производилась корректировка аннотации хроматограммы и создание более точного консенсуса с учетом знания прямого и обратных прочтений. Некоторые проблемные места описаны в следующем пункте данного упражнения. Итоговый консенсус: ссылка; проект в Ugene: ссылка.

Рисунок 1. Выравнивание прямого и обратных прочтений с общим консенсусом.

Проблемные места хроматограммы:

На данном участке хроматограммы есть два неопределенных нуклеотида с уровнем шума выше среднего, поскольку нет хроматограммы комплементарного рида, было решено 2 нуклеотид оставить неопределенным, т.к. уровень шума слишком высок, а 4 изменить на аденин.

В этом участке хроматограммы есть два плохо разделившихся нуклеотида, но поскольку есть комплементарная хорошо разрешенная хроматограмма, было решено изменить 57 нуклеотид на аденин, а 58 на гуанин.

На нижней хроматограмме, видимо, образовалаось пятно краски гуанинового флуорофора, которое повлияло на соседние пики, но поскольку есть комплементарная хорошо разрешенная хроматограмма, было решено изменить 258 нуклеотид на гуанин. Примечательно также, что остальные нуклеотиды, на которые повлияло это пятно, аннотировались правильно, что говорит о качестве алгоритмов расшифровки.

На нижней хроматограмме заметны сильные искажения в последовательности пиков, но так как верхняя хроматограмма обладает хорошим разрешением, можно восстановить исходную последовательность и предположить пятно краски или искажения геля, вызвавшие подобный эффект. 299 нуклеотид решено изменить на аденин. Также как и в прошлом примере, хочется отметить качество алгоритмов чтения хроматограмм, т.к. возникло только одно затруднение при чтении этого проблемного участка.

На данном участке хроматограммы присутствует три проблемных нуклеотида с высоким уровнем шума, из-за отсутствия комплементарного прочтения вывод о точной последовательности не очень точный 375 и 378 нуклеотиды решено заменить на неизвестный пиримидины (Y), а 384 нуклеотид оставить в виде неизвестного из-за черезмерно высокого уровня шума.

Кроме вышеперечисленных, были отрецензированы все проблемные нуклеотды в данном выравнивании. С результатами составления консенсуса можно ознакомиться:

• В проекте Jalview. Первая строка - консенсус, две другие - риды. Все нуклеотиды, относительно которых принимались какие-либо решения изменены на строчные.
• В проекте Ugene. Первые два файла - прямая и обратная хроматограммы; третий файл - выровненный контиг из этих ридов. Все проблемные нуклеотиды также отрецензированы.
• Консенсус в формате fasta.

2) Нечитаемые фрагменты хроматограммы:

Участки хроматограмм могут быть нечитаемыми по разным причинам, две из которых будут разобраны в данном упражнении:

В данном случае приведен участок с начала хроматограммы, где помимо изучаемого образца фиксируется свечение отдельных нуклеотидов, флуорофоров и других неспецифичных коротких последовательностей, которые сильно затрудняют расшифровку хроматограммы.

На этой хроматограмме видно характер распределения пиков, когда в изучаемой последовательности происходит инсерция-делеция. Этот участок находится посередине хроматограммы, и можно увидеть момент, когда начинается несовпадение пиков. В данном случае индель величиной 1 нуклеотид.