Парное выравнивание. Поиск по сходству

Для выполнения данной работы я использовала последовательность белка фенилацетат-коэнзим А лигазы из генома бактерии Bacteroides Thetaiotaomicron (NP_809341.1) и сервис BLASTP на сайте NCBI.

Задание 1. Собрание выборки гомологов белка phenylacetate-coenzyme A ligase при помощи программы BLASTP из базы Refseq.

Я зарегистрировалась на сайте NCBI, вошла в личный кабинет, после чего запустила программу Protein BLAST (поиск схожих участков в последовательностях белков) по алгоритму blastp (protein-protein BLAST) для базы данных Refseq (refseq_protein). При использовании параметров по умолчанию (100 последовательностей на выходе без таксономического ограничения), оказалось, что у данного белка в базе очень много гомологов. В первой сотне у самой худшей находки E-value составлял 0.0, при выдаче тысячи самый плохой показатель E-value был равен 8e-128. Следовательно, необходимо было ограничить поиск таксоном и запросить больше последовательностей. Ограничение по таксону Bacteria не принесло особых результатов (так как было найдено более 15000 последовательностей), ведь исследуемый белок бактериальный, но ограничение в рамках Bacteroidetes позволило сократить выборку до 762 последовательностей, включая исходную. Среди них есть 522, гомологичные вышеупомянутому белку по всей длине (query cover > 80%).
Ссылка на файл стратегии поиска
Рассмотрим некоторые характеристики 3 находок blastp (см. таблицу 1):

Если воспользоваться условным критерием определения гомологичной последовательности (E-value < 1e-3 и Query cover >= 70%), то можем насчитать 521 гомолог.
Выборка из 27 последовательностей

Задание 2. Построение множественного выравнивания последовательностей из полученной выборки.

Требовалось скачать последовательности в .fasta и с помощью JailView построить множественное выравнивание алгоритмом Muscle с параметрами по умолчанию (BLOSUM62 с порогом по консервативности 30%, были удалены невыровненные N- и C-концы). Вертикальные блоки, удовлетворяющие использованному ранее техническому определению, отмечены символом "B". Приведены примеры блоков, объединяющих значительное количество последовательностей (но не все), обозначеных символом "H". Количество блоков обоих видов позволяет с большой долей вероятности говорить о гомологии в отмеченных участках.
Ссылка на проект Jalview

Задание 3. Глобальное и локальное выравнивание исследуемого белка и худшей находки из выборки.

При выполнении задания использовались команды needle и water на сервере kodomo. Выравнивания построены для белков со следующими идентификаторами: WP_008760705.1 и WP_039343202.1. На вход программа требует две последовательности в fasta-формате, величины штрафов за первый гэп (по умолчанию 10.0) и за продление гэпа (по умолчанию 0.5). Needle строит оптимальное глобальное выравнивание двух последовательностей по алгоритму динамического программирования Needleman-Wunsch, основанному на подсчете веса каждого выравнивания (используя матрицу весов и значения штрафов за гэпы, которые определяются пользователем), а затем изучения каждого выравнивания с целью выбрать наилучшее. Выходной файл в fasta-формате можно получить, используя функцию -aformat fasta. Water строит локальные выравнивания (выравнивания неполных последовательностей, имеющие максимальный счет). По умолчанию needle выдает файлы формата .needle, а water соответственно .water, содержащие выравнивание с аннотацией (указывано не только прямое совпадение, но и сходство аминокислот, которые могут быть отмечены одной или двумя точками).

1. Глобальное выравнивание, выданное needle.

2. Глобальное выравнивание, полученное из множественного.

3. Локальное выравнивание, выданное water.

3. Локальное выравнивание, выданное BLAST.

Задание 4. Выравнивание различных выравниваний друг относительно друга.

Добавлением гэпов было получено выравнивание выравниваний относительно друг друга. В целом достаточно схожи между собой локальные выравнивания, а те участки, которые были выравнены программами по-разному, показывают различие в их алгоритмах. Пример же участка (170-180) с неодинаковым выравниванием можно видеть на рисунке ниже. Интересен тот факт, что на данном примере видно: различаются как глобальные (2 верхних), так и локальные (2 нижних) выравнивания на участке 170-180. Больше всего совпадений наблюдалось в множественном выравнивании и выравнивании, полученном с помощью BLAST.

Задание 5. Парные выравнивания последовательностей двух заведомо негомологичных белков

В пару к своему белку я взяла случайный белок из таблицы: Deoxyribodipyrimidine photo-lyase, Agrobacterium fabrum str. C58 (RefSeq ID: NP_354235.1) и провела те же операции, что в заданиях 3 и 4 (построила выравнивания в needle и water и выровняла их в Jalview друг относительно друга). Выравнивания, полученные разными программами, в большей степени не совпадают. Это связано с большим числом гэпов и маленьким количеством консервативных колонок (наблюдаются только в позициях 400-450). Следовательно, выравнивания недостоверны и по ним нельзя делать выводы о гомологичности анализируемых белков.