Posted Sunday, November 19, 2016 by Marina Gladkova. Renewed Saturday, December 4, 2016

Предсказание генов прокариот.

Задание 1. Сравнение предсказаний генов в базе данных GenBank и по данным Prodigal для плазмиды.


1. Подготовка файлов для анализа.

В этом задании с помощью EMBOSS был получен файл выданной мне плазмиды (CP014286) в формате gff. Из него была извлечена информация о координатах последовательностей, кодирующих белки (начало, конец и ориентация соотвестственно). Ниже приведены соответствующие команды и ссылки на полученные файлы.
seqret embl:CP014286 CP014286.fasta
seqret embl:CP014286 -feature CP014286.gff
grep CDS CP014286.gff | awk '{print $4 " " $5 " " $7}' > CP014286_feat
Благодаря первой команде из базы данных EMBL была сохранена нужная мне последовательность в fasta-формате. Cледующая команда, используя квалификатор -feature, перезаписала файл в табличный gff-формат особенностей. Далее командой grep были найдены все паттерны, содержащие "CDS", перенаправлены утилите awk для извлечения данных столбцов с номерами 4, 5 и 7, где содержатся координаты. [1] Результаты направлены в файл CP014286_feat.


Указанный идентификатор относится к последовательности Bacillus thuringiensis strain Bt185 plasmid pBT1850054 размером 54205 п.о. Имеет 72 гена, 71 из которых белок-кодирующий, 1 - псевдоген, определяемый как нефункциональная копия генетического фрагмента, включенного в геном путем ретротранспозиции мРНК или дупликации геномной ДНК. [2]
Bacillus thuringiensis (Bt) - грамположительная почвенная бактерия, зачастую используется в качестве биопестицида. Во время споруляции многие штаммы образуют кристализующиеся белковые включения, называемые δ-эндотоксинами, имеющими инсектицидное действие. [3]


Bacillus thuringiensis, покраска по Граму, увеличение 1000 X


Показан процесс инфицирования гусеницы, которая съедает спору Bt. [4]


2. Предсказание генов с помощью Prodigal.

Prodigal - программное обеспечение для предсказания генов, кодирующих белки в геномах бактерий и архей. Работает из командной строки. Акроним был получен в результате слияния PROkaryotic DYnamic Programming Genefinding ALgorithm.

Что может делать программа?
  • предсказывать белок-кодирующие гены (в табличных форматах GFF3, GenBank, Sequin);
  • работать с проектами геномов и метагеномов;
  • работать быстро;
  • работать по алгоритму неконтролируемого обучения (автоматически определяет характеристики генома исходя из последовательности, включая генетический код, RBS (ribosomal binding site) motif usage, start codon usage и статистику кодирования);
  • работать (с дополнительными настраевыми пользователем параметрами) с гэпами, скэффолдами и частями генов;
  • идентифицировать сайты инициации трансляции;
  • давать на выходе подробную статистику по изученному геному
Что не может делать программа?
  • предсказывать гены РНК;
  • изучать гены с интронами;
  • аннотировать предсказанные гены по функциям;
  • работать с рамками считывания (не может учитывать индели, что приводит к ошибкам в предсказании)
Поддерживаются 3 режима работы:
Normal Mode, в котором Prodigal изучает поданную на вход последовательность, узнает ее характеристики и делает на их основе предсказание. Используется для изучения полных геномов, геномных проектов хорошего качества и больших вирусах.
Anonymous Mode, в котором Prodigal использует заранее сделанные калькуляции для исследуемой последовательности и предсказывает гены, основываясь на лучших результатах. Используется для изучения метагеномов, геномных проектов низкого качества, маленьких вирусах и плазмидах.
Training Mode, принцип работы которого совпадает с нормальным режимом, но кроме этого сохраняются тестовые файлы для дальнейшего использования.
 

prodigal.windows.exe -c -i CP014286.fasta -o CP014286_prodigal
prodigal.windows.exe -c -i CP014286.fasta -o CP014286.pro -f sco
После установки на ПК данная программа была запущена с представленными выше параметрами, а именно: -i (input_file) - последовательность на входе, -o (output_file) - последовательность на выходе. При запуске программы без квалификатора -c Prodigal начал предсказывать гены с 3-го основания, что противоречит и здравому смыслу, и данным аннотации GenBank. Квалификатор -s записывает все потенциально посчитанные гены вместе со scores, с помощью квалификатора -f был получен итоговый файл CP014286.pro в рекоммендуемом минималистичном формате .sco.
Для получения отформатированного файла CP014286.pro_feat, содержащего только координаты генов, был использован скрипт changeform1.py.


3. Сравнение и результаты.

Для сравнения двух файлов (CP014286_feat и CP014286.pro_feat) был написан скрипт в Python comparison1.py. Подробное описание работы программы закомментировано, поэтому здесь лишь опишу основную идею: путем создания списков и сравнения в них элементов-координат (например, положительная ориентация означает, что координата N-конца - первая, в противном случае - вторая), удалось однозначно установить соответствие между списками генов, выявить гены с одним несовпадающим концом и вообще не аннотированные гены.

Результаты
Число аннотированных в Genbank генов74
Число предсказанных Prodigal генов77
Число генов с двумя совпадающими концами66
Процент генов, совпадающих обоими концами89,19%
Число генов с неправильно определенным N-концом1
Процент генов с неправильно определенным N-концом1,35%
Число генов с неправильно определенным C-концом1
Процент генов с неправильно определенным C-концом1,35%
Число не совпавших генов6
Процент не совпавших генов8,1%


4. Причины несовпадения.

Вообще говоря, предсказания Prodigal для плазмиды CP014286 оказались достаточно хорошими (почти 90% верно определенных генов). Как в случае с C-, так и с N-концами неправильно предсказанных "на половину" генов оказалось по одному. 
¡К сожалению, при перепроверке вручную я обнаружила, что программа неправильно 
посчитала количество не совпавших N- и C-концов (по данным моей программы их по 
одному в каждом случае, но по моим подсчетам для С-концов ошибок не было вообще, 
для N-концов по результатам Prodigal не совпало 5 генов). Однако установить причину 
ошибки и найти логическую ошибку в скрипте мне не удалось. Буду очень признательна, 
если Вы поможете мне выяснить причину такого расхождения. Соотвественно, диаграмму 
и таблицу в предыдущем задании нельзя считать достоверными!
В качестве такого примера для N-конца выступает ген AXW78_29345, расположенный на позициях 5629 - 6165, кодирующий ДНК-связывющий белок AMR06410. Prodigal предсказал его так: 5710 6165 +, с ошибкой на 21 нуклеотид. Причиной ошибки может быть определение программой в качестве стартового кодона триплета TTG (в отличие от аннотированного ATG). Оба эти варианта по данным трансляционной таблицы 11 (The Bacterial, Archaeal and Plant Plastid Code) могут являться стартовыми у бактерий. Если смотреть подробное описание со scores, то разница между предложенным алгоритмом вариантом (72.31) и реальным геном (61.70) составляет 10.61 балла.

Ген AXW78_29345 в последовательности Genbank



Результаты работы программы (из файла prodigal_potscores)



Другим примером несоответствия N-конца является рассчет для гена AXW78_29370, расположенного на позициях 8557 - 9693 (-), кодирующего аспартат-фосфатазу. Предсказание Prodigal оказалось короче - всего с 8557 по 9657 (-). По описанию, качественные баллы предсказанных и аннотированных координат различаются на почти 17 баллов. Но в данном случае, наоборот, программа посчитала наиболее вероятным стартовым кодоном тривиальный вариант ATG для метионина, нежели описанный в Genbank TTG.

Результаты работы программы (из файла prodigal_potscores)





Источники