Множественное выравнивание. Паттерны.

Поиск по паттерну в банке Swiss-Prot.

Создание паттернов для поиска и распознавания аминокислотных последовательностей.

1. Создание множественного выравнивания последовательности белка ASPG2_ECOLI и 4х его гипотетических ортологов.

   • * С помощью программы blastp (на сервере NCBI, ведь NCBI позволяет получить сразу несколько последовательностей в формате FASTA...) в банке Swiss-Prot найдены гомологи ASPG2_ECOLI; из них выбраны 4 ортолога: ASPG2_BACSU, ASPG2_HAEIN, ASPG2_SCHPO, ASPG2_YEAST - в дальнейшем такую выборку я буду именовать "вспомогательным" вариантом. Критерии отбора: совпадение названий белков из разных организмов и процент идентичности (40-80%) - это было указано в задании. В полученной выборке процент идентичности составляет от 39% до 68% (ASPG2_BACSU - 53%, ASPG2_HAEIN - 68%, ASPG2_SCHPO - 39%, ASPG2_YEAST - 40%)
     Последовательности найденных белков плюс последовательность ASPG2_ECOLI можно увидеть здесь.

     ** Еще вариант (основной) - я выбрала последовательности других белков (как 4х наиболее вероятных ортологов): ASPG2_BACSU, ASPG2_HAEIN,ASPG_HELPY, ASPG_WOLSU. Критерием отбора стал процент идентичности в диапазоне 47-68% (в частности, ASPG2_BACSU - 53%; ASPG2_HAEIN - 68%; ASPG_HELPY - 47%; ASPG_WOLSU - 53%). E-value находoк - наилучшие ( небольшое "отступление" от этого принципа в случае с ASPG_HELPY: можно было бы рассмотереть ASPG_HELPJ, для которого значение E-value ниже, чем у ASPG_HELPY (следовательно, лучше...), однако "любопытства ради" был отобран "кандидат" с меньшим процентом идентичности).
     Последовательности найденных белков плюс последовательность ASPG2_ECOLI можно увидеть здесь.

     А есть ли смысл приводить 2 варианта?.. Думаю, да. А объяснение такое: при составлении паттернов интересно будет сравнить 2 множественных выравнивания, консервативные аминокислотные остатки,соответствующие замены а.о... Переходим непосредственно к выравниваниям:

   • С помощью программы muscle построено множественное выравнивание белка ASPG2_ECOLI и его "ортологов"; затем оно импортировано в GeneDoc. Основной вариант можно увидеть здесь. Вот еще одно множественное выравнивание ("вспомогательный" вариант).

2. Создание паттернов по множественному выравниванию; проведение поиска по паттернам в банке данных Swiss-Prot.
   • Из полученного выравнивания ("основной вариант") выбран консервативный фрагмент выравнивания длиной 16 а.о. (позиции 209 - 224 выравнивания) для дальнейшего исследования:

     *

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     E

     C

     O

     L

     :

     G

     R

     D

     V

     T

     K

     T

     N

     T

     T

     D

     V

     A

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     B

     A

     C

     S

     :

     A

     R

     Y

     V

     T

     K

     T

     N

     T

     T

     T

     T

     D

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     H

     A

     E

     I

     :

     A

     R

     D

     V

     T

     K

     T

     S

     T

     T

     A

     V

     Q

     T

     F

     H

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     _

     H

     E

     L

     P

     Y

     :

     A

     R

     E

     V

     I

     K

     T

     H

     T

     T

     H

     T

     S

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     _

     W

     O

     L

     S

     U

     :

     A

     R

     E

     A

     T

     K

     L

     N

     T

     T

     A

     V

     N

     A

     F

     A

     :

     1

     6

     R

     K

     T

     T

     F

   • Создаю 3 паттерна ("правила игры" - см. здесь): первый паттерн в точности является фрагментом последовательности белка ASPG2_ECOLI; второй ("сильный") паттерн строю так, чтобы он распознавал все белки выборки, и только их; третий ("слабый") паттерн - на основе второго, сделав требования к последовательности более мягкими. Результат - см. таблицу.

     Проведен поиск последовательностей банка Swiss-Prot (online - через БД PROSITE: раздел "Tools for PROSITE", далее - переход по гиперссылке "ScanProsite", затем ввод паттерна в правом окне, кнопка START THE SCAN - получаем результат), включающих мотивы, соответствующие каждому из полученных паттернов.

     Поиск по паттерну в банке Swiss-Prot.

     Характеристика паттерна	Паттерн	В скольких последовательностях банка Swiss-Prot найден мотив, удовлетворяющий паттерну?	Все ли последовательности из Вашего выравнивания найдены?
     Фрагмент последовательности	GRDVTKTNTTDVATFK	1	Нет, только последовательность ASPG2_ECOLI
     Сильный***	[GA]-R-[DYE]-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-TT-[DTAH]-[VT]-[ADQSN]-[TA]-F-[KHA] ([GA]-R-[DYE]-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-TT-X(4)-F-[KHA])	5	Да
     Слабый	R-{GA}-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-T-X(5)-F	5	Да

   Наблюдения и размышления:

   • первый паттерн - фрагмент последовательности белка ASPG2_ECOLI, состоящий из 16 а.о. Как и предполагалось, найдена была только последовательность исследуемого белка. Однако любопытство взяло верх, поэтому решено было проследить: "Какова минимальная длина фрагмента (из рассматриваемого участка) может быть, чтоб на запрос выдавалась единственная последовательность - последовательность ASPG2_ECOLI?" Я последовательно "отрезала" по 1 а.о. от N- и C-концов. В итоге, минимальная длина фрагмента для выполнения поставленной задачи составила 7 a.o. - фрагмент KTNTTDV. Возможно, если "отрезать" аминокислотные остатки в другом порядке, то значение ("минимальное") может оказаться другим. С фрагментом из 6 а.о. - KTNTTD - нашлись 2 последовательности: последовательность ASPG2_ECOLI и последовательность белка LYAT_BACSU - связанный с мембраной белок lytR.

   • второй паттерн - паттерн, распознающий все белки выборки (и только их). Основная идея при составлении такого паттерна - включить все позиции фрагмента выравнивания, а в каждой позиции разрешить все буквы, встретившиеся в какой-либо из последовательностей.
     *** Некоторое "отступление": конечно, для "100%ой строгости" надо было только такой паттерн указать в таблице: [GA]-R-[DYE]-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-TT-[DTAH]-[VT]-[ADQSN]-[TA]-F-[KHA] (результат поиска: найдено 5 последовательностей, все принадлежат белкам выборки) - однако это нерационально в данном случае; я заменила элемент [DTAH]-[VT]-[ADQSN]-[TA] на X(4). Результат поиска по такому "смягченному" паттерну (все равно, в нем остались "строгие" рамки) оказался удовлетворительным (см. таблицу) - найдены только последовательности множественного выравнивания. Хотя тут не обошлось без доли везения :-) Очевидно, что существуют еще варианты написания паттернов, удовлетворяющих данному условию: например, паттерн вида [GA]-R-X(2)-[TI]-K-X(2)-TT-X(4)-F-[KHA]...

   • третий паттерн - "слабый", создается на основе второго (т.е. "сильного" паттерна). В предыдущем пункте, по сути, уже велся разговор о таких "вариантах". Вот один из них: R-{GA}-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-T-X(5)-F. Здесь "отрезаны" по позиции с каждого из концов; целый "кусок" обозначен как X(5), а второй элемент паттерна задан как {GA} - такой вот "отказ" от "маленьких" и гидрофобных (отличие от D, E...) аминокислотных остатков. Результаты поиска указаны в таблице.
     То же получается по паттерну {GA}-[VA]-[TI]-K-[TL]-[NSH]-T-X(5)-F .

   • Составляя паттерн, нужно четко определить, зачем вообще все это делается (т.е. "чего в итоге получить-то надо?"). При выполнении "комбинированной" части задания как раз и пригодилось то самое "вспомогательное выравнивание". Вот из него соответствующий фрагмент:

     *

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     E

     C

     O

     L

     :

     G

     R

     D

     V

     T

     K

     T

     N

     T

     T

     D

     V

     A

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     B

     A

     C

     S

     :

     A

     R

     Y

     V

     T

     K

     T

     N

     T

     T

     T

     T

     D

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     H

     A

     E

     I

     :

     A

     R

     D

     V

     T

     K

     T

     S

     T

     T

     A

     V

     Q

     T

     F

     H

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     S

     C

     H

     P

     :

     A

     F

     Y

     T

     T

     K

     T

     N

     G

     N

     T

     L

     D

     T

     F

     K

     :

     1

     6

     A

     S

     P

     G

     2

     _

     Y

     E

     A

     S

     :

     G

     F

     W

     T

     T

     K

     M

     N

     A

     N

     S

     L

     D

     T

     F

     R

     :

     1

     6

     T

     K

     T

     F

     "Общие-неизменные" (с "основным" фрагментом выравнивания) аминокислотные остатки: лизин - в 6 позиции, фенилаланин - в 15й.

     Задача вполне конкретная: создать такой паттерн, чтоб по результатам поиска выдавались, соответственно, только последовательности белков из обоих выравниваний. В результате "хитроумных деяний" - преобразований "слабого" паттерна (собственно, занятие для "растяжки мозгов") получился: [GA]-[RF]-{I}-X-[TI]-K-X(3)-[TN]-X(3)-[TA]-F-X.
     В результате, в 10 последовательностях банка Swiss-Prot найден заданный мотив.7 из них - "то, что надо"; а оставшиеся 3 - белки ASPG1_SCHPO, ASPG3_SCHPO, ASPG4_SCHPО (предшественники L-аспарагиназ 1, 3,4...)."Убрать" из выборки, преобразовывав паттерн [GA]-[RF]-{I}-X-[TI]-K-X(3)-[TN]-X(3)-[TA]-F-X на рассматриваемом участке (в 16 а.о.), можно только ASPG1_SCHPO и ASPG3_SCHPO. Для этого участок [TN]-X(3)-[TA] заменяю на [TN]-{M}-X(2)-[TA]. Тогда получаю паттерн вида [GA]-[RF]-{I}-X-[TI]-K-X(3)-[TN]-{M}-X(2)-[TA]-F-X - это и есть ответ на задачу. А исключить ASPG4_SCHPО из результатов поиска таким способом не получится: у ASPG2_SCHPО и ASPG4_SCHPО паттерном задаются абсолютно идентичные участки вида AFYtTKtngNtldTFk - изменения в паттерне могут привести к исчезновению не только ASPG4_SCHPО, но и ASPG2_SCHPО из результатов поиска.