Ресеквенирование и поиск полиморфизмов у человека

Работа велась по хромосоме №6.

Таблица 1. Использованные команды
hisat2-build chr6.fasta index/chr6.idx	Индексация референсной последовательности.
fastqc reads/chr6.fastq	Проверка качества чтений программой FastQC, получение html-страницы с результатом.
java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr6.fastq chr6_trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:50	Очистка чтений при помощи Trimmomatic. Убирает с концов нуклеотиды с качеством прочтения ниже 20 и отбрасывает последовательности длиной менее 50 нуклеотидов.
fastqc reads/chr6_trimmed.fastq	Анализ качества чтений, прошедших процедуру триммирования, получение html-страницы с результатом.
hisat2 -x index/chr6.idx -U reads/chr6_trimmed.fastq -S map/chr6_align.sam --no-softclip --no-spliced-alignment	Картирование чтений: построение выравнивания прочтений и проиндексированного референса в формате .sam.
samtools view -b map/chr6_align.sam -o map/chr6_align.bam	Перевод файла с выравниванием в бинарный формат .bam.
samtools sort map/chr6_align.bam map/chr6_align_sorted	Сортировка выравнивания по координате в референсе.
samtools flagstat map/chr6_align.sam	Индексация отсортированного файла
samtools mpileup -uf chr6.fasta map/chr6_align_sorted.bam -o chr6_snp.bcf	Получение основной информации о картировании, в том числе числа откартированных чтений.
bcftools call -cv chr6_snp.bcf -o chr6_snp.vcf	Создание файла с полиморфизмами.
convert2annovar.pl -format vcf4 chr6_snp.vcf -outfile chr6_snp.avinput	Перевод файла в формат, распознаваемый annovar
annotate_variation.pl -out refgene -build hg19 -dbtype refGene chr6_snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по базе данных refGene
annotate_variation.pl -filter -out dbsnp -build hg19 -dbtype snp138 chr6_snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по базе данных dbsnp
annotate_variation.pl -filter -dbtype 1000g2014oct_all -buildver hg19 -out genomes chr6_snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по базе данных 1000 genomes
annotate_variation.pl -regionanno -build hg19 -out gwas -dbtype gwasCatalog chr6_snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по базе данных Gwas
annotate_variation.pl chr6_snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/ -filter -dbtype clinvar_20150629 -buildver hg19 -out clinvar	Аннотация по базе данных Clinvar

Анализ качества чтений. Триммирование.

После запуска программы FastQC до и после триммирования были получены html-файлы, содержащие отчёт о качестве чтений: до триммирования - отчёт №1, после триммирования - отчёт №2 Изначально было получено 10289 чтений. Качество чтений до очистки отображено на Рис. 1. С помощью Trimmomatic с конца каждого чтения были отрезаны нуклеотиды с качеством ниже 20, после чего оставлены только чтения длиной не меньше 50 нуклеотидов. После очистки осталось 10123 ридов. Качество чтений после очистки отображено на Рис. 2.

качество чтений до триммирования — **Рис. 1.** Качество чтений до триммирования.

Из рисунка 1 мы видим, что не все основания имеют качество выше 20, после триммирования эти основания обрезаются.

качество чтений после триммирования — **Рис. 2.** Качество чтений после триммирования.

После триммирования из 10289 прочтений осталось 10123, было отброшено 166 - это менее 2% (1,61%). Сравнение остальных графиков не показало существенных изменений, разве что в графиках "Per sequence quality scores" есть небольшие различия - в гафике, составленном после триммирования количество последовательностей с качеством, меньше 20 равно 0, чего нельзя сказать о другом графике (Рис. 3, 4). Поэтому, я считаю, что можно было обойтись без триммирования.

график качества чтений до триммирования — **Рис. 3.** График распределения последовательностей по качеству перед очисткой.

график качества чтений после триммирования — **Рис. 4.** График распределения последовательностей по качеству после очистки.

Картирование ридов

Команда "hisat2 -x index/chr6.idx -U reads/chr6_trimmed.fastq -S map/chr6_align.sam --no-softclip --no-spliced-alignment" вывела результат:

10123 reads; of these:
  10123 (100.00%) were unpaired; of these:
    77 (0.76%) aligned 0 times
    10046 (99.24%) aligned exactly 1 time
    0 (0.00%) aligned >1 times
99.24% overall alignment rate

из которого понятно, что всего на хромосому было картировано 10123 чтения (99.24%). Поэтому можно сделать вывод, что качество картирования высокое.

При рассмотрении файла chr6_snp.vcf с полиморфизмами понятно, что из 84 полиморфизмов 5 инделей и 79 snp. Описание трёх полиморфизмов приведено в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика полиморфизмов
№	Координата	Тип полиморфизма	Референс	Чтения	Глубина покрытия	Качество
1.	106961119	замена	T	C	6	36,0297
2.	107016135	замена	A	G	33	159,009
3.	154344146	вставка	tc	tCc	1	3,25208

База данных refseq в annovar обозначила 3 категории SNP (файл refgene.variant_function):

Таблица 3. Характеристика полиморфизмов
№	Категория	Количество SNP в группе
1.	exonic	9
2.	intronic	42
3.	UTR3	2

Гистограммы, отражающие распределение полиморфизмов по качеству прочтения и глубине покрытия приведены на рисунках 5, 6.

качество полиморфизмов — **Рис. 5.** Распределение полиморфизмов по качеству прочтения.

глубина покрытия полиморфизмов — **Рис. 6.** Распределение полиморфизмов по глубине покрытия.

Гены, в которые попали SNP: AIM1, TNFAIP3, OPRM1.

Нуклеотидные замены приведены в том же файле refgene.variant_function:

intronic	AIM1	chr6	106961119	106961119	T	C	het	36.0297	6
intronic	AIM1	chr6	106966701	106966701	A	G	hom	65.5132	4
intronic	AIM1	chr6	106966801	106966801	T	C	het	137.008	25
exonic		AIM1	chr6	106967185	106967185	A	C	het	177.009	38
exonic		AIM1	chr6	106967778	106967778	T	C	het	183.009	26
exonic		AIM1	chr6	106967833	106967833	G	A	het	191.009	25
exonic		AIM1	chr6	106968091	106968091	C	T	het	114.008	19
exonic		AIM1	chr6	106968369	106968369	G	A	het	218.009	41
intronic	AIM1	chr6	106974933	106974933	T	G	het	81.013	5
intronic	AIM1	chr6	106975415	106975415	A	T	het	225.009	46
intronic	AIM1	chr6	106976802	106976802	G	T	het	3.01618	1
intronic	AIM1	chr6	106978314	106978314	G	A	het	183.009	170
intronic	AIM1	chr6	106980118	106980118	G	C	hom	10.4247	1
intronic	AIM1	chr6	106982532	106982532	G	T	hom	11.3429	1
intronic	AIM1	chr6	106982560	106982560	G	A	hom	9.52546	1
intronic	AIM1	chr6	106982642	106982642	G	A	hom	5.46383	1
intronic	AIM1	chr6	106982672	106982672	T	C	hom	6.20226	1
intronic	AIM1	chr6	106982931	106982931	G	T	hom	7.79993	1
intronic	AIM1	chr6	106987019	106987019	T	C	hom	65.9724	4
intronic	AIM1	chr6	106987161	106987161	A	G	hom	221.999	57
exonic		AIM1	chr6	106987370	106987370	A	C	hom	221.999	88
intronic	AIM1	chr6	106989212	106989212	G	A	hom	221.999	36
intronic	AIM1	chr6	106991195	106991195	G	A	hom	180.999	25
intronic	AIM1	chr6	106991747	106991747	G	A	hom	7.79993	1
exonic		AIM1	chr6	106992464	106992464	A	G	hom	221.999	58
intronic	AIM1	chr6	106992592	106992592	A	T	hom	221.999	77
intronic	AIM1	chr6	106992844	106992844	C	G	hom	221.999	25
intronic	AIM1	chr6	106998973	106998973	T	C	het	4.13164	1
intronic	AIM1	chr6	106999658	106999658	A	T	hom	221.999	36
intronic	AIM1	chr6	107001456	107001456	A	T	het	169.009	25
intronic	AIM1	chr6	107001581	107001581	T	C	het	113.008	9
intronic	AIM1	chr6	107003444	107003444	G	C	het	81.0075	10
intronic	AIM1	chr6	107003810	107003810	T	C	het	225.009	65
intronic	AIM1	chr6	107006120	107006120	C	-	hom	15.1077	5
intronic	AIM1	chr6	107006336	107006336	G	C	het	225.009	51
intronic	AIM1	chr6	107008422	107008422	C	T	hom	101.264	5
intronic	AIM1	chr6	107008430	107008430	C	T	hom	116.133	6
intronic	AIM1	chr6	107009090	107009090	G	A	het	94.0077	9
intronic	AIM1	chr6	107009119	107009119	A	G	het	114.008	11
intronic	AIM1	chr6	107011930	107011930	T	C	hom	176.001	12
intronic	AIM1	chr6	107014734	107014734	A	G	hom	11.3429	1
intronic	AIM1	chr6	107016127	107016127	G	C	het	145.008	28
intronic	AIM1	chr6	107016135	107016135	A	G	het	159.009	33
intronic	AIM1	chr6	107016136	107016136	T	G	het	157.009	33
UTR3		AIM1(NM_001624:c.*290T>C)	chr6	107016731	107016731	T	C	het	225.009	70
UTR3		AIM1(NM_001624:c.*400_*401insTT)	chr6	107016841	107016841	-	TT	het	217.468	36
exonic		TNFAIP3	chr6	138192607	138192607	G	T	het	28.0137	29
intronic	TNFAIP3	chr6	138192745	138192745	G	A	het	15.1417	4
intronic	TNFAIP3	chr6	138192761	138192761	A	G	het	5.4626	2
intronic	TNFAIP3	chr6	138195693	138195693	T	C	hom	41.7648	2
intronic	TNFAIP3	chr6	138195723	138195723	C	G	het	65.0073	9
exonic		TNFAIP3	chr6	138196066	138196066	T	G	het	225.009	46
intronic	TNFAIP3	chr6	138197331	138197331	A	C	het	111.008	27
intronic	TNFAIP3	chr6	138197824	138197824	C	T	het	5.46092	2
intronic	OPRM1	chr6	154344147	154344147	-	C	het	3.25208	1
intronic	OPRM1	chr6	154344284	154344284	C	T	hom	9.52546	1
intronic	OPRM1	chr6	154357986	154357986	T	G	hom	11.3429	1
intronic	OPRM1	chr6	154357987	154357987	A	C	hom	11.3429	1
exonic		OPRM1	chr6	154360569	154360569	C	T	het	165.009	23
exonic		OPRM1	chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
intronic	OPRM1	chr6	154362920	154362920	-	T	het	4.4191	1
intronic	OPRM1	chr6	154382542	154382542	A	G	hom	7.79993	1
intronic	OPRM1	chr6	154382572	154382572	G	T	het	5.46137	2
intronic	OPRM1	chr6	154387317	154387317	G	T	hom	39.765	2
intronic	OPRM1	chr6	154392675	154392675	T	C	hom	11.3429	1
intronic	OPRM1	chr6	154402589	154402589	C	T	hom	11.3429	1
intronic	OPRM1	chr6	154406316	154406316	A	G	hom	10.4247	1
intronic	OPRM1	chr6	154411847	154411847	C	T	het	50.0106	4
exonic		OPRM1	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
exonic		OPRM1	chr6	154414446	154414446	A	T	hom	221.999	85
exonic		OPRM1	chr6	154414563	154414563	A	G	hom	221.999	84
intronic	OPRM1	chr6	154417209	154417209	G	T	hom	6.20226	1
intronic	OPRM1	chr6	154422744	154422744	G	A	hom	7.79993	1
intronic	OPRM1	chr6	154423714	154423714	C	G	hom	6.20226	1
intronic	OPRM1	chr6	154426153	154426153	T	C	hom	6.20226	1
intronic	OPRM1	chr6	154428537	154428537	G	A	het	73.0074	15
exonic		OPRM1	chr6	154428666	154428666	C	T	het	225.009	26
UTR3		OPRM1(NM_001145286:c.*4A>G)	chr6	154428702	154428702	A	G	hom	221.999	24
UTR3		OPRM1(NM_001145284:c.*162delT)	chr6	154429092	154429092	T	-	hom	18.7798	7
intronic	OPRM1	chr6	154431393	154431393	C	G	hom	221.999	20
UTR3		OPRM1(NM_001145282:c.*19G>A)	chr6	154431565	154431565	G	A	het	218.009	27
intronic	OPRM1	chr6	154431742	154431742	G	T	hom	9.52546	1
intronic	OPRM1	chr6	154436236	154436236	T	C	hom	10.4247	1
intronic	OPRM1	chr6	154437252	154437252	A	G	hom	11.3429	1

Аминокислотные замены приведены файле refgene.exonic_variant_function:

line4	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon2:c.A878C:p.Q293P,		chr6	106967185	106967185	A	C	het	177.009	38
line5	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon2:c.T1471C:p.C491R,		chr6	106967778	106967778	T	C	het	183.009	26
line6	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon2:c.G1526A:p.R509H,		chr6	106967833	106967833	G	A	het	191.009	25
line7	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon2:c.C1784T:p.A595V,		chr6	106968091	106968091	C	T	het	114.008	19
line8	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon2:c.G2062A:p.D688N,		chr6	106968369	106968369	G	A	het	218.009	41
line21	nonsynonymous SNV	AIM1:NM_001624:exon7:c.A3587C:p.E1196A,		chr6	106987370	106987370	A	C	hom	221.999	88
line25	synonymous SNV		AIM1:NM_001624:exon10:c.A3834G:p.K1278K,	chr6	106992464	106992464	A	G	hom	221.999	58
line47	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_001270508:exon2:c.G243T:p.K81N,	chr6	138192607	138192607	G	T	het	28.0137	29
line47	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_006290:exon2:c.G243T:p.K81N,		chr6	138192607	138192607	G	T	het	28.0137	29
line47	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_001270507:exon2:c.G243T:p.K81N,	chr6	138192607	138192607	G	T	het	28.0137	29
line52	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_001270508:exon3:c.T380G:p.F127C,	chr6	138196066	138196066	T	G	het	225.009	46
line52	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_006290:exon3:c.T380G:p.F127C,	chr6	138196066	138196066	T	G	het	225.009	46
line52	nonsynonymous SNV	TNFAIP3:NM_001270507:exon3:c.T380G:p.F127C,	chr6	138196066	138196066	T	G	het	225.009	46
line59	stopgain		OPRM1:NM_001145279:exon3:c.C169T:p.Q57X,	chr6	154360569	154360569	C	T	het	165.009	23
line59	stopgain		OPRM1:NM_001285524:exon2:c.C169T:p.Q57X,	chr6	154360569	154360569	C	T	het	165.009	23
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001145285:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_000914:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001145284:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001285522:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001008503:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001285523:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001145279:exon3:c.C296T:p.A99V,	chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001145282:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001008504:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001145286:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001285524:exon2:c.C296T:p.A99V,	chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line60	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001008505:exon1:c.C17T:p.A6V,		chr6	154360696	154360696	C	T	hom	221.999	21
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145285:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_000914:exon3:c.G942A:p.T314T,		chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145284:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145283:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001008503:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001285523:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145279:exon5:c.G1221A:p.T407T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001285528:exon2:c.G642A:p.T214T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145282:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145280:exon3:c.G642A:p.T214T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145287:exon3:c.G642A:p.T214T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145281:exon3:c.G699A:p.T233T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001008504:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001145286:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001285527:exon2:c.G642A:p.T214T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001285524:exon4:c.G1221A:p.T407T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001008505:exon3:c.G942A:p.T314T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line69	synonymous SNV		OPRM1:NM_001285526:exon3:c.G642A:p.T214T,	chr6	154412385	154412385	G	A	het	225.009	59
line70	nonsynonymous SNV	OPRM1:NM_001008505:exon4:c.A1206T:p.Q402H,	chr6	154414446	154414446	A	T	hom	221.999	85
line71	synonymous SNV		OPRM1:NM_001008505:exon4:c.A1323G:p.G441G,	chr6	154414563	154414563	A	G	hom	221.999	84
line77	stopgain		OPRM1:NM_001145286:exon4:c.C1231T:p.Q411X,	chr6	154428666	154428666	C	T	het	225.009	26

84 SNP имеет RS, что известно из результатов работы с базой snp138.

Частоту найденых SNP можно узнать из результатов работы с базой 1000genomes. Она колеблется от 0,00658946 до 0,987819 (оба значения относятся к интронам), среднее составляет 0,454245787.

Клиническую аннотацию полиморфизмов можно узнать из результатов работы с базой Gwas. Было найдено всего 4 полиморфизма, имеющих клиническую аннотацию из них есть полиморфизмы, приводящие к инсульту, ревматоидному артриту, ишемической болезни сердца и системной красной волчанке.

Назад

Главная страница