Первый этап: описание функциональных особенностей заданной группы.
FruR - фруктозный репрессор, который выполняет двойственную функцию в регуляции направления энергетического метаболизма: он является активатором для генов, кодирующих белки, ответственные за глюконеогенез, цикл Кребса, глиоксилатный путь, и репрессором для генов, кодирующих гликолитические белки и белки-участники пути Энтнера-Доудорофа. Для активации должен связаться с фруктозой 1-фосфат или фруктозой 1,6-дифосфат. Связывается с участком ДНК, длиной 18 пар нуклеотидов.
Фруктоза
Второй этап: создание множественного выравнивания доменов с разметкой по группам специфичности.
Создание хорошего множественного выравнивания доменов заданной группы белков.
Из БД Pfam было получено выравнивание эффектор-связывающего домена белков, семейства лактозных репрессоров, из которого с помощью скрипта были вырезаны нужные последовательности (последовательности фруктозных репрессоров). (выравнивание в формате fasta)
Создание единого множественного выравнивания заданных доменов всех групп специфичности.
Для создания единого множественного выравнивания эффектор-связывающих доменов белков семейства лактозных репрессоров, выравнивания разных групп специфичности были импортированы в GenDoc. (выравнивание в формате fasta) (выравнивание в формате msf) (изображение выравнивания)
Не обнаружил ни одной позиции, консервативной для всех групп или консервативной в пределах каждой группы, но в которой находятся разные остатки в разных группах. Есть высоко консервативные позиции (нумерация по позиции в выравнивании) во всех последовательностях: 34 G, 72 G, 143 P и 190 G, причем ни в одной последовательности из группы Frur в позии 190 не стоит G. Нашел несколько консервативных участков для фруктозных репрессоров, не встречающиеся в последовательностях других групп: 49-50 E N, 59-61 {R,K} {L,I} A, 212-213 {I,V} S. 59 - позиция, консервативная для многих групп, в которой в разных группах часто разные аминокислоты.
Для установления значимости найденых позиций для связывания с эффектором был получен PDB файл одного белка из семейства лактозных репрессоров - Iptg_Ecoli - в комплексе с эффектором. Далее средствами PyMol были получены номера остатков, находящихся на расстоянии менее 4 А от эффектора. Последовательность из PDB была выровнена с последовательностью Frur_Ecoli и на ней были отмечены остатки, вероятно взаимодействующие с эффектором.
Синим отмечены позиции, достаточно консервативные во всех последовательностях семейства, зеленым - вероятно взаимодействующие с эффектором, а красными - консервативные участки в группе Frur, которые не встречаются в последовательностях других групп специфичности.
Таким образом, остатки S 15, Y 16, W 145, K 146 действительно могут влиять на связывание определенного эффектора, так как располагаются в последовательности в непосредственной близости от остатков, вероято взаимодействующих с эффектором.
Создание лого-изображения полного выравнивания заданных доменов и выравнивания доменов заданной группы специфичности.
C помощью сайта WebLogo были созданы лого изображения для выравниваний группы фруктозного репрессора и всех групп, в которых предварительно были удалены колонки с гэпами. (Лого группы Frur) (Общее лого)
Третий этап: поиск вероятных фруктозных репрессоров в протеоме бактерии Marinomonas sp. (strain MWYL1).
Создание профиля по множественному выравниванию заданной группы специфичности.
При помощи последовательности команд:
pfw -m EFBFrur.fasta > wEFBFrur.fasta - добавление весов к выравниванию
pfmake -m wEFBFrur.fasta /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > prEFBFrur.prof - создание профиля
autoscale -m prEFBFrur.prof > npEFBFrur.prof - нормирование профиля относительно случайной базы
был получен профиль.
Поиск по профилю в протеоме бактерии Marinomonas sp. (strain MWYL1).
При помощи команды:
pfsearch -f -C 12.0 -x npEFBFrur.prof Marinomonas.fasta > 12.fasta - порог 12.0 был выбран для получения оптимального числа находок (результат для порога 10.0 и 15.0)
Фрагмент выравнивания. Синими стрелочками отмечены позиции, достаточно консервативные во всех последовательностях семейства, а красными - консервативные участки в группе Frur, которые не встречаются в последовательностях других групп специфичности.
По выравниванию видно, что позиции, достаточно консервативные во всех последовательностях семейства, большей частью консервативны и у находок, а участки, которые встречаются только в последовательностях группы Frur, не встретились ниразу в находках. Стоит отметить, что G в позиции 127 выравнивания, который достаточно консервативен во всем семействе, а в группе Frur в этой позиции не встречается, присутствует в последовательностях почти всех находок. Таким образом:
В протеоме бактерии Marinomonas sp. (strain MWYL1) не было найдено белков группы фруктозных репрессоров, однако белки семейства лактозного репрессора скорее всего присутствуют.
2010
©