Практикум 5.
1. Работа с KEGG ORTHOLOGY
Цель данного задания – проверить, являются ли члены разных ортологических рядов KEGG гомологичными белками, и проанализировать их филогенетические отношения.
В качестве метаболического пути был выбран биосинтез лизина, реакция - L-2-Aminoadipate-6-semialdehyde:NAD(P)+ 6-oxidoreductase.
Уравнение реакции: alpha-Aminoadipoyl-S-acyl enzyme + NADPH + H+ <=> L-2-Aminoadipate 6-semialdehyde + Holo-Lys2 + NADP+
Идентификаторы ортологических рядов KEGG: K00143 и K14085.
Ссылка на страницу K00143 в KEGG Ссылка на страницу K14085 в KEGGСхема метаболического пути биосинтеза лизина (Reference Pathway) с данной реакцией (покрашена в красный цвет):
1.Получение последовательностей белков и построение множественного выравнивания
Ортологический ряд K00143: 106 последовательностей белков (102 в UniProt, 4 в SWISS-PROT)
Ортологический ряд K14085: 118 последовательностей белков (110 в UniProt, 8 в SWISS-PROT)
Я брала только последовательности из UniProt, поскольку так было сказано в задании.
Получив последовательности, я объединила их в один файл и выровняла в JalView с помощью веб-сервиса, методом Muscle.
Ссылка на выравнивание в формате FASTA
Ссылка на проект JalView. Из выравнивания удалены слишком коротние белки (см. ниже в тексте)
Проверка выравнивания
Белков, которые были бы очень плохо выровнены с остальными, не оказалось. Я также проверила выравнивание на предмет коротких белков с большим количеством гэпов там, где в других последовательностях выравнивания консервативные колонки. Обнаружилось около десятка таких белков, которые я удалила из выравнивания. Затем я покрасила выравнивание раскраской ClustalX.
Гомологичность белков в выравнивании
Я думаю, что последовательности из разных кластеров не гомологичны. Аргументы в пользу этого вывода следующие: в выравнивании (пока будем называть его так, игнорируя вопрос правомерности использования этого термина) присутствует довольно много функционально консервативных колонок, а именно таких участков, где внутри каждого кластера консервативная колонка, но между кластерами ее консервативность только функциональная (пример на рис. 2). Наличие функционально схожих мест неудивительно, поскольку белки обоих ортологических рядов катализируют одну и ту же реакцию. Однако столь низкая идентичность консервативных мест в последовательностях подталкивает меня к выводу, что белки разных кластеров не гомологичны. Можно ли данное выравнивание считать настоящим выравниванием, я затрудняюсь сказать ввиду отсутствия четких критериев определения. Функциональное сходство последовательностей определенно присутствует.
Рис.2 Фрагмент выравнивания ортологический рядов K00143 и K14085. Видно, что последовательности, консервативные внутри кластера, сильно различаются между кластерами, хотя и сходны функционально.
Я решила все-таки построить филогенетическое дерево по данным последовательностям (программой MEGA, методом Neighbor-Joining, со 100 бутстреп-репликами). Картинка с результатом приведена ниже (рис.3).
Дерево распадается на клады, соответствующие отдельным ортологическим рядам, которые мы рассматривали. Величина поддержки бутстрепом ветвей, отделяющих эти клады от остального дерева, равна 99, то есть поддержка очень хорошая.
На дереве нет тривиальных ветвей, длина которых существенно отличалась бы от остальных.
Рис.3 Дерево, построенное по данным последовательностям методом Neighbor-Joining, со 100 бутстреп-репликами.