Практикум 5

Задание 1. Вводное

В данном практикуме я рассмотрел две структуры одной молекулы лигазы UFC1 человека, полученных методами РСА (7NW1) и ЯМР (7OVC).
Определение структуры белка методом ядерного магнитного резонанса отличается от метода РСА и имеет свои особенности. Образец находится в растворе, а не в кристалле, при этом регистрируются химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия для ЯМР-активных ядер. Полученные данные дают набор ограничений, по которым рассчитываются возможные конформации молекулы, или состояния. Такой набор состояний может отражать динамику белка в растворе, но может и содержать вклад погрешностей эксперимента.
Сопоставим модели, полученые в результате экспериментов. На Рисунке 1 представлена модель РСА (цепь 7NW1 B), выравненная на модели ЯМР (цепь 7OVC A) с помощью команды super. Видно, что в целом структуры накладываются друг на друга почти полностью, а ансамбль ЯМР хорошо сходится, за исключением С-конца. На этом же конце две структуры накладываются плохо, а для конформаций ЯМР на этом участке определяется α-спираль. Другое различие в наложении двух экспериментальных моделей представлено на Рисунке 2. Здесь две петли в форме буквы S лежат в перпендикулярных плоскостях.
Я пердположил, что эти два различия связаны с положением молекулы белка в кристалле при проведении РСА, поэтому конформация получается несколько смещенной относительно ЯМР ансамбля. Я достроил соседей по ячейке для 7NW1 и заметил, что C-конец одной молекулы взаимодействует с вышеупомянутой петлей другой молекулы. На Рисунке 3 представлено такое возможное взаимодействие. Азот гуанидиновой группы ARG-111 может вступать в π-катионный стекинг с гистидином-161, а азот остова - образовывать водородную связь с глутамином 160. Далее я выбрал остаток ARG-64 и сравнил его положение в двух моделях (Рисунок 4). Во-первых, для моделей ЯМР определены водороды, так как их ядра являются ЯМР-активными и их спектры регистрируются. Возможно, в 7NW1 водороды не определены, так как разрешение нетостаточно высокое - 1.95 Å. Во-вторых, боковые цепи аргинина во всех моделях ЯМР развернуты вокруг связи CA-CB в противоположную сторону от положения этого остатка по данным РСА. Также достроив соседние молекулы, я посчитал возможным взаимодействие этого остатка аргинина с одной из соседних по кристаллу молекул. На Рисунке 5 показаны возможный стекинг гуанидиновых групп аргининов и водородная связь от NH к O еще одного остатка аргинина.
Нельзя утверждать, что отличия в положении групп и цепей в этих двух структурах определяются только взаимодействиями крислаллизованных молекул, но в случае двух рассмотренных примеров это, скорее всего, так; ансамбль ЯМР при этом может в какой-то мере отражать колебания в растворе, которые гораздо сильнее таковых в кристаллах.

Рисунок 1. Общий вид выравненных структур. 7OVC покрашена зеленым, 7NM1 - синим.

Рисунок 2. Отличие в положении остовов вне вторичной структуры.

Рисунок 3. Взаимодействие между соседями в кристалле.

Рисунок 4. Отличное положение остатков аргинина 64 в РСА и ЯМР моделях.

Рисунок 5. Взаимодействие между соседями в кристалле.

Задание 2. RMSF

В данном задании я рассчитал и сравнил две меры подвижности атомов - RMSF и В-фактор. Если ансамбль ЯМР моделей действительно повторяет днамику белка в растворе, то RMSF, рассчитанный по нему, будет соответствовать значениям B-фактора аналогичных атомов из РСА модели.
Рассчитаем эти показатели для каждого остатка и сопоставим. Чтобы првильно соотнести остатки, я посмотрел на аминокислотную последовательность белковых молекул в двух структурах. Последовательность в структуре ЯМР (GLY1 - GLN168) длиннее таковой в РС эксперименте (ASP3-CYS166) на 2 а.к. с каждого из концов, а в остальном они совпадают полностью. На Рисунке 6 представлено совместное распределение средних RMSF 7OVC и средних B-факторов 7NW1 для соответствующих остатков. Чтобы установить наличие корреляции между параметрами, посчитаем коэффициент ранговой корреляции Спирмана, H0: ρ = 0 (условие применения - объем выборок больше 5 - выполняется, нормальное распределение не требуется). Коэффициент равен 0.33, p-value = 1.43 10^-5, что позволяет отвергнуть нулевую гипотезу и сказать, что данные показатели коррелированы.
Тем не менее, нельзя говорить о наличии какой-то причинно-следственной связи между ними и нельзя принять, например, B-факторы за априорный показатель и делать вывод, соответствуют ли им значения RMSF и отражает ли ансамбль ЯМР моделей динамику белка в растворе. Аналогичный вывод можно сделать, сопоставив значения RMSF для каждого атома 7OVC и значения RMSF, рассчитанные из B-факторов 7NW1 по формуле RMSF = 3B/8/π^2 (Рисунок 7). Коэффициент Спирмана также значимо отличается от нуля и равен 0.40. Видно, что соответствие формуле плохое, есть достаточно сильный разброс в данных.

Рисунок 6. Распределение средних RMSF (ЯМР струкутра) и В-факторов (РСА) для отдельных остатков.

Начиная с ASP-3 до CYS-166 аминоксилотная последовательность и все атомы в выбранных молекулах идентичны. Можем сопоставить RMSF для всех атомов 7OVC_A и RMSF, посчитанное из B - факторов, для всех атомов 7NW1_B.

Рисунок 7. RMSF, рассчитанные по В-факторам из РСА модели, и RMSF для моделей ЯМР - для каждого атома, кроме водородов.

Задание 3

В данном задании я изучил, как в моделях ЯМР сохраняется расстояние между донорами и акцепторами водородных связей, которые прослеживаются в РС модели. Я выбрал три связи: связь кислорода остова аланина 135 и азота остова аланина 139, которые находятся в α-спирали внутри белка (Рисуонок 8), связь кислорода боковой группы тирозина 90 и азотов NH боковой группы аргинина 31 (два азота гуанидиновой группы идентичны), которые также находятся внутри белка (Рисунок 9), и связь кислорода OD1 аспарагина 128 и азота боковой цепи лизина 131, которые находятся на поверхности пелка в составе петель и смотрят в раствор (Рисунок 10). Я рассчитал расстояние между этимим атомами во всех конформациях ЯМР структуры и установил, что первая связь присутствует в 95% конформаций, вторая - в 30%, а последняя - ни в одной.
Первая связь находится внутри молекулы белка и поддерживает структуру α-спирали, возможные колебания в растворе и в кристалле здесь минимальны. Вторая связь образуется уже реже, тирозин 90 в РСА модели не очень хорошо накладывается на конформации ЯМР. Возможно, здесь уже существенно сказывается движения молекулы в растворе. Расстояние же между OD1 аспарагина 128 и NZ лизина 131 минимально составляет 6.5 Å, что почти в два раза больше допустимой дистанции установления водородной связи, что уже однозначно запрещает ее формирование. Если все-таки допустить, что ансамбль моделей как-то отражает движения молекулы белка в растворе, то колебания поверхностных остатков можно объяснить образованием водородных связей с водой, с молекулами которой тем больше возможность связаться, чем сильнее остаток открыт в раствор.

Таблица 1. Параметры водородных связей в РСА и ЯМР моделях.

Рисунок 8. Водородная связь между ALA-135 и ALA-139, синим - РСА модель, зеленым - ЯМР модели.

Рисунок 9. Водородная связь между ARG-31 и TYR-90, синим - РСА модель, зеленым - ЯМР модели.

Рисунок 10. Водородная связь между LYS-131 и ASN_128, синим - РСА модель, зеленым - ЯМР модели.