Семестр VII. Другие полезные умения

d1. Определение вторичной структуры

Для работы была выбрана структура 1BAM - эндонуклеаза рестрикции BamHI. В PDB-файле модели этой структуры уже указана разметка вторичной структуры - 7 альфаспиралей и 7 бета-листов:

HELIX    1  A1 ASP A   10  LEU A   16  1                                   7    
HELIX    2  A2 LYS A   20  CYS A   34  1                                  15    
HELIX    3  A3 VAL A   58  ASP A   70  1                                  13    
HELIX	4  A4 ILE A  117  LYS A  132  1                                  16    
HELIX	5  A5 LYS A  146  ALA A  149  1                                   4    
HELIX	6  A6 PHE A  159  THR A  169  1 SEE REMARK 6.                     11    
HELIX	7  A7 LYS A  200  GLU A  211  1                                  12    
SHEET	1  SA 6 TYR A  75  ARG A  76  0                                        
SHEET	2	SA 6 VAL A  95  GLU A 101 -1                                       
SHEET	3  SA 6 GLU A 104  PHE A 112 -1                                        
SHEET	4  SA 6 ASP A 137  PRO A 144  1                                        
SHEET	5  SA 6 PHE A 174  ASN A 180  1                                        
SHEET	6  SA 6 GLU A   2  ILE A   8 -1                                        
SHEET	1  SB 2 THR A  46  ASN A  48  0                                        
SHEET	2  SB 2 ALA A 183  ASN A 185  1 

REMARK 650 HELIX                                                                
REMARK 650 HELIX A6 IS A MIXTURE OF TYPE 1 AND TYPE 5.  PRO 164 IN THE          
REMARK 650 MIDDLE OF THE HELIX KINKS IT.  RESIDUES 159 - 162 FORM AN            
REMARK 650 ALPHA HELIX.  RESIDUE 163 - 165 AND 166 - 169 FORM A 3/10            
REMARK 650 HELIX.

Рис.1. Общий вид структуры 1BAM

DSSP

DSSP был запущен на kodomo:

mkdssp -i 1BAM.pdb -o 1BAM.dssp

Результат работы алгоритма представлен в файле 1BAM.dssp. Координаты спиралей и листов определились достаточно точно. Несовпадение с разметкой PBD-файла только в одной спирали и в одном листе, но только на 1 и 2 остатка:

138-144 <= SHEET	4  SA 6 ASP A 137  PRO A 144  1
58-72 <= HELIX    3  A3 VAL A   58  ASP A   70  1

Кроме того, программа правильно определила особенность спирали HELIX: PHE159 - THR169, в том, что со 163 остатка это 3/10 спираль (в PDB-файле эта особенность тоже отмечена и объяснена - PRO164 изгибает спираль). Так же в структуре были найдены искривленные участки (bends) и повороты полипептидной цепи. Еще обнаружились такие изолированные бета-тяжи (В), которые состоят из одиночных остатков, что вообще-то не очень верно.

Рис.2. Изгиб спирали под влиянием PRO164

SheeP

Структура 1BAM была загружена на веб-сервис для построения карт бета-листов SheeP.

Рис.3. Карта одного из бета-листов структуры (самого большого), полученная при помощь SheeP

На карте видно, что это один большой бета-лист. На Рис. 4 показано расположение этого бета-листа во всей структуре. Так как струтура представляет собой сэндвич, сложно сказать, где гидрофильная сторона, а где гидрофобная. Все остальные бета-тяжи определены более менее точно, кроме того, что представлен на Рис.5 (все определенные SheeP листы - в проволочной модели, розовые петли по разметке, желтые тяжи по разметке, голубые - спирали).

Рис.4. Структура 1BAM с показанным самым большим бета-листом цепи (жирные линии). Серым и красным отмечены атомы, торчащие в разные стороны от листа.

Рис.5. Ошибочное определение бета-листа. Дополнительный бета-лист (розовая проволочная - должна быть петля, а там тяжи).

Рис.6. Самый длинный хребет бета-листа: остатки 76,95,110,140,175,8 цепи А предствалены в виде остова, совпадает с разметкой PDB-файла.

d2. Совмещение структур

Совмещение структуры кроличьей ГАФД с ее структурными гомологами

Cтруктурные гомологи белка были найдены при помощи сервиса PDBeFold => launch => pairwise 3D alignment, query - PDB код, target – whole pdb archive, поиск структурных гомологов для всех цепей, lowest acceptable match по умолчанию 70%. В таблице с находками было выбрано 6 разных белков с RMSD (оценка сходства) от 0,8 до 2,5 ангстрем и N_align(число сопоставленных C_alpha) от 50% до 90%. Сервис сам показывает картинку совмещения структур(Рис. 7). Можно сказать, что структуры в первом приближении очень похожи.

Рис.7. Совмещение структуры 1J0X и ее пяти структурных гомологов.

Выравнивание последовательностей по совмещению структур; совмещение структур.
Выравнивание последовательностей Tcoffee. Рассмотрим петлю 3hja:D 102-105. В структурно выравнивании она не совпадает с другими структурами, что видно на картинке (Рис.8). Из выравниваний (Рис.9) видно, что аминокослоты надо 106-109 для последней последовательностью плохо выравниваются с любым участком из куска 102-109, поэтому все равно куда их плохо выровнять. Поэтому сложно сказать, где правильное выравнивание. В принципе, выравнивания очень похожи.

Рис.8. Совмещение структуры 1J0X и ее пяти структурных гомологов, выпетливание невыравнивающегося участка.

Рис.9. Выравнивания структурных гомологов структуры 1J0X (JalView, раскраска Clustalx по консервативности 30%).

Совмещение структур альфа и бета доменов константной части T-клеточного рецептора

Была выбрана структура 1OGA: альфа-цепь region d:118-202, бета-цепь region e:119-245.

Рис.10. Альфа и бета домены структуры 1OGA.

Рис.11. SheeP карта бета-листа для альфа-цепочки.

Рис.12. SheeP карта бета-листа для бета-цепочки.

Два консервативных цистеина Cys134:D (альфа-домен) и Cys145:E (бета-домен) отмечены желтым. Выравнивание структур бета-листа альфа-домена и бета-листов бета-домена приведено на рисунке 13. Для выравнивания были взяти девять СА атомов вокруг цистеина (включая его СА атом, остаток отмечен желтым). Для удобства сравнения - только бета-тяжи, так как петли все равно различаются и являются нерегулярными и более подвижными элементами структуры.


Рис.13. Выравнивание структур бета-листа альфа-домена и первого (ближе к альфа-домену) бета-листа бета-домена. pair_fit alpha_list///121-123+133-135+174-176/CA, beta_1///126-128+144-146+191-193/CA	Рис.13. Выравнивание структур бета-листа альфа-домена и второго (дальше от альфа-домена) бета-листа бета-домена. pair_fit alpha_list///121-123+133-135+174-176/CA, beta_2///236-238+209-211+158-160/CA

RMSD первого наложения 0,485, второго 0,548, хотя визуально я бы сказала, что со вторым листом бета-домена выравнивается лучше. Я считаю, что сходство топологий наблюдается во втором случае, так как качество наложения не сильно хуже, но зато количество и направление бета-тяжей совпадает.

Скрипт для получения изображений.

d3. Нахождение гидрофобных кластеров

Найдем гидрофобные кластеры в структуре соматической кроличьей ГАФД ( PDB-код - 1J0X ). Для этого будем использовать Clud.

Parameters:

Atom list: strict
Model number (for NMR): 1
All chains selected
Distance threshold: 4.5 Å (при большем расстоянии туда сможет поместиться молекула воды)
Cluster size threshold: 5;

Output files:

1j0x.rsc RasMol script
1j0x.txt text table

При запуске алгоритма с такими параметрами всего нашлось 76 кластеров, а больше заданного размера - 42. Два самый больших (Рис.14) представляют собой как бы объединение цепей парами, включая из NAD⁺-связывающие домены (это укладка Россмана => там есть гидрофобные контакты между тяжами и спиралями). Так же отдельны были найдены функциональные домены для всех цепей - каталитический (Рис.15) и NAD⁺-связывающий домены, что несет уже больше биологического смысла (Рис.16). Так же обнаружились гидрофобные контакты между цепями (Рис.17-21).


Рис.14. Два самый больших найденных гидрофобных кластера (напоминают interlock по пространственному расположению =)).	Рис.15. C-концевой домен каталитический домены

Рис.16. NAD⁺-связывающие домены	Рис.17. Взаимодействия между цепями Q-R и P-Q.

Рис.18. Взаимодействия между цепями O-R.	Рис.19. Взаимодействия между цепями O-Q.

Рис.20. Взаимодействия между цепями P-O.	Рис.21. Взаимодействия между цепями P-R.

d4. Построение поверхности, раскраска участка поверхности: PyMol

Для комплекса димера пуринового репрессора с ДНК (PDB-код 1QP7) с помощью средств PyMol были созданы изображения:

а) поверхности контакта мономера белка с симметричным мономером на фоне остовной (ribbon) модели мономера;
б) поверхности контакта димера белков с двойной спиралью ДНК на фоне остовной модели части белка, вовлечённой в контакт;
в) поверхности контакта ДНК с димером белков на фоне проволочной (sticks) модели двойной спирали.

Рис.22. Изображение димера белка в комплексе с ДНК.

Рис.23. Изображение поверхности контакта между мономерами белка. Контакт определялся расстоянием меньше или равном 5.0 ангстрем. Контакты с ДНК не учитывались.

Рис.24. Изображение поверхности контакта димера белков с двойной спиралью ДНК на фоне остовной модели части белка, вовлечённой в контакт.

Рис.25. Изображение поверхности контакта ДНК с димером белков на фоне проволочной (sticks) модели двойной спирали.

С помощью сервиса CluD, были определены гидрофобные кластеры объёмом не менее 10 атомов на интерфейсе мономеров белка в том же комплексе (Рис. 26) - их получилось 4.

Рис.26. Гидрофобные кластеры между мономерами, найденные CluD.

Рис.27. Изображение поверхностей атомов мономера белка, образующих гидрофобные контакты с другим мономером. Атомы, входящие в гидрофобные кластеры, найденные CluD, окрашены синим.

Скрипт для получения изображений.

d5. Сравнение доменов SCOP и Pfam

Для человеческого кальмодулина (Uniprot ID CALM_HUMAN, PDB структура 1CLL) найдем границы доменов в SCOP и Pfam. Поиск человеческого кальмодулина по PDB ID по базе данных Pfam обнаружил наличие двух доменов EF-hand (координаты 7-73 и 85-146). Поиск по SCOP - ничего адекватного относительно координат не дал, однако в классификации указано, что там две пары кальций-связывающих доменов EF-hands, а для всех других записей определил координаты как на весь белок целиком почти от самого начала цепи. Поэтому я для точности посмотрела еще описание доменов в Uniprot. Благодаря разметке Uniprot можно понять, что коротелькийбета-тяж+петля+кусок альфа-спирали составляют центр связывания кальция, и две пары кальций-связывающих доменов (домены идут прямо один за другим) действительно разделены альфа-спиральным шарниром, как и положено.
Скрипт для получения изображений.


Рис.28. Домены Pfam.	Рис.29. Домены SCOP.

Рис.30. Классификация SCOP.

Рис.31. Домены Uniprot.

Рис.32. Домены Uniprot.

Рис.33. Участки связывания кальция Uniprot.

Рис.34. Домены Pfam (желтым, 7-73, 85-146).	Рис.35. Домены Uniprot (розовым, 8-43, 44-79, 81-116, 117-149; красным - кальций-связывающие центры).