Исследование структуры тРНК

  1. Краткое описание структуры в файле 1I9V.pdb

    2. В файле приведены координаты атомов молекулы тРНК для фенилаланина в комплексе с неомицином.
    Организм Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Кроме тРНК этом документе представлены координаты лигандов - иона магния и собственно неомицин (антибиотик).
    Для исследования была выбрана цепь А (единственная), представляющая фенилаланин-тРНК со следующей последовательностью:

    [1] 5' GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGAGAGCGCCAGACUGAAYGAUCUGGAGGUCCUGUG5MUUCGAUCCACAGAAUUCGCACCA 3' [76]
    ,где 1 и 76 - номера первого и последнего нуклеотида, YG [37] и 5MU [54] - модифицированные нуклеотиды: вибутозин и 5-метилурацил, соответственно (выделены в последовательности подчеркиванием).

    Модифицированные основания

    YG - WYBUTOSINE:Систематическое название 1H-IMIDAZO(1,2-ALPHA)PURINE-7-BUTANOIC ACID,4,9-DIHYDRO-ALPHA-((METHOXYCARBONYL)AMINO)- 4,6-DIMETHYL-9-OXO-METHYL ESTER. Практически, это сильно модифицированный гуанозин. Это основание соединяется с рибозой посредством стандартной N9-C1' связи.

    5MU: 5-метилурацил, или риботимидин (обозначение 5MU, позиция 54). Фактически, это основание тимидин, но поскольку тимидина в РНК обычно не бывает, принято считать, что это модифицированный урацил. Или риботимидин, что значит - тиминовое основание, но на рибозе.

    На 3'-конце есть триплет CCA, к которому присоединяется аминокислота. Этот триплет есть и в PDB файле.

  2. Исследование вторичной структуры

    3. С помощью программы find_pair пакета 3DNA были определены возможные водородные связи между азотистыми основаниями. Использовали команду
    find_pair -t 1I9V.pdb pairs.inp
    Получили файл pairs.inp В соответствии с полученными данными
    акцепторный стебель состоит из участка 1-7 и комплементарного ему участка 72-66.
    Т-стебель - 49-53 и 65-61
    D-стебель - 10-13 и 25-22
    антикодоновый стебель - 40-44 и 30-26

    Структуру стеблевых дуплексов поддерживают 20 канонических и 1 неканоническая пара оснований.
    Неканоническая пара :

    Рис.1. Вторичная структура фенилаланин-тРНК 
    Скрипт для получения изображения
select all
wireframe off
backbone 50
color black
background white
select 1-7 or 66-72
color red
backbone 100
select 49-53 or 61-65
backbone 100
color green
select 10-13 or 22-25
backbone 100
color blue
select 26-30 or 40-44
color orange
backbone 100

    Контактирующие пары: a44.n6 - g26.o6 и a44.n1 - g26.n1 .
    Вариабельная петля отсутствует, в Т-петле есть 5-метилурацил, или риботимидин (обозначение 5MU, позиция 54).
    Дигидроуридины в D-петле отсутствуют

    Антикодон в антикодоновой петле - A-A-YG (35-37 нуклеотиды)
    YG - WYBUTOSINE (описание см. в пункте1).

  3. Исследование третичной структуры

    4. 1)Для изучения стекинг взаимодействия используем файлы, полученные с помошью команды
    find pair -t 1I9V.pdb stdout | analyze
    В файле 1I9V.out Находим информацию о перекрытиях оснований (поиск (F7) по слову overlap). Выбираем перекрытия .Им соответствуют структуры 11 и 12 из файла stacking.pdb. 

           step     i1-i2      i1-j2       j1-i2         j1-j2                sum

  7   UC/GA  0.00( 0.00)   0.00( 0.00)  0.00( 0.00)   2.93( 1.39)       2.93( 1.39)

  20 AG/CG  0.00( 0.00)   0.00( 0.00)   0.71( 0.00)   0.59( 0.08)      1.30( 0.08)
    Чтобы получить картинки сначала вырезаем нужные фрагменты
    ex_str -7 stacking.pdb step7.pdb
    ex_str -12 stacking.pdb step20.pdb
    Потом делаем из них картинки
    stack2img -cdolt step7.pdb step10.ps
    stack2img -cdolt step20.pdb step12.ps
    Между концом акцепторного стебля
    и началом Т-тебля
    U 7 : A 66 / C 49: G 65
    Площадь перекрытия 2.93( 1.39)     		Между антикодоновым и D-стеблем
    A 44: G 26 / G 10 : C 25
    Площадь перекрытия 1.30( 0.08)




    Выводы: стекинг-взаимодействие между парами оснований на "границе" антикодонового и D-стеблей очень мало, в этом месте общая для стеблей цепь изгибается и комплиментарные ей основания (44 и 10) сильно разобщены в пространстве. А аналогичное взаимодействие между основаниями акцепторного и Т стеблей более существенно и может иметь влияние на пространственную структуру молекулы.

    2)Дополнительные водородные связи между основаниями D- и T-петель.

    Взаимное расположение этих контактов в пространстве

    Водородные связи образуют основания С56 и G19 D и Т петель, а также основание G15 D-петли с основанием C48 в цепи между Т-стеблем и акцепторным стеблем. На рисунке красным цветом показаны нуклеотиды D-шпильки (петля и стебель), зеленым - Т-шпильки (петля и стебель)

    Реальная и предсказанная вторичная структура тРНК из файла 1I9V.pdb

    Участок структуры
    		Позиции в структуре
    (по результатам find_pair)     		Результаты предсказания
    с помощью einverted     		Результаты предсказания
    по алгоритму Зукера
    Акцепторный стебель 5'1-7 3'
    5' 66-72 3'
    Всего 7 пар     		ни оной пары не предсказано из этого промежутка 6 из 7 пар
    D-стебель 10-13
    22-25
    4 пары     		нуклеотиды 22-25 "спарены" с другой цепью (10-13) все 4 правильные
    T-стебель 49-53
    65-61
    5 пар     		все 5 пар правильные все 5 пар правильные
    Антикодоновый стебель 40-44
    30-26
    5 пар     		все 5 пар предсказаны, есть 1 лишняя стебель на 1 пару сдвинут (то есть одной не хватает, и одна лишняя)
    Общее число канонических пар нуклеотидов 21 всего 15, правильно 11 всего 20 пар,все правильно

    Изображение, полученное с помощью mfold 

    Использовались значения параметров:
-для программы einverted  уменьшали параметр threshold  до 10, 
пока не появился осмысленный результат, другие параметры оставили по умолчанию.
-для программы mfolt взяли P=15. Одна из полученных картинок достаточно хорошо вписывается в 
каноническую структуру "клеверного листа". Если увеличить Р до 20ти, вариантов значительно больше, но новых "клеверных листов" 
среди них мало (только один и очень "кривой").