Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями.(Продолжение)

Работа с программой getorf пакета EMBOSS

Получим файл с записью D89965 банка EMBL.

entret embl:D89965 -auto

Выполните команду

 tfm getorf

для D89965 так, чтобы получить набор трансляций всех открытых рамок данной последовательности длиной более 30 нуклеотидов (открытая рамка - последовательность триплетов, начинающаяся со старт-кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном, при использовании бактериального кода).

getorf -minsize 30 -find 1 -table 11
Finds and extracts open reading frames (ORFs)
Input nucleotide sequence(s): d89965.entret
protein output sequence(s) [d89965.orf]: d89965.orf

Пятая открытая рамка соответствует приведённой в записи CDS. 13 рамка соответствует записи Swiss-Prot, на которую ссылается данная запись EMBL.


Поиск некодирующих последовательностей программой BLASTN

Запустим программу blastn, указав в качестве последовательностей для поиска файл trna_ecoli.fasta, в качестве банка — геном бактерии Pasteurella multocida с функцией "-m 8" программы blastall. Порог E-value не указываем. Получим выходной файл.

С помощью команды:

grep valV genome.txt -c

мы узнаем количество строк, включающих информацию для белка valV.

Создадим в файле Excel колонку из названий входных последовательностей. Затем создадим скрипт, в результате работы которого мы узнаем количество находок для каждой такой последовательности.

Повторим поиск, на этот раз указав порог на E-value, равный 0.001,добавив таблицу столбец.

Результат работы : Excel.

Поиск некодирующих последовательностей программой megablast

Повторим предыдущее задание, используя вместо BLASTN сначала обычный megablast, а затем разрывный ("discontigous") megablast. Программа megablast запускается с опциями, большая часть которых аналогична опциям программы blastall; чтобы запустить discontigous megablast, нужно явно указать правильные значения опций "-t", "-W" и "-N".

Командные строки:

megablast -d index -i trna_ecoli.fasta -o mblast.txt -m 8

megablast -d index -i trna_ecoli.fasta -o mblas.txt -m 8 
-N 1 -W 11 -t 16

Результаты помещены в соотвествующие столбцы в файле Excel.

Анализ результатов

Выберем пару из tRNA E.coli и найденного в геноме Pasteurella multocida гомологичного участка из заданий 2 и 3, такую, которая находится программой BLASTN и не находится программой megablast - selC. Про программу megablast сказано, что она предназначена для выравнивания последовательностей, отличающихся незначительно (ошибки в секвенировании), а так же длинной поиска последовательности. Скорее всего,именно из-за поиска длинных последовательностей megablast не нашел последовательность в отличие от программы blastn.

Вырежем участок тРНК E.coli- selC в отдельный файл командой seqret -sask и гомологичный из другой бактерии (AE006214). Выровняем две последовательности программой needle.

Gap_penalty: 10.0
Extend_penalty: 0.5

Length: 95
Identity:      61/95 (64.2%)
Similarity:    61/95 (64.2%)
Gaps:          22/95 (23.2%)
Score: 257.0
    

Данный участок проаннотирован - селеноцистеин тРНК. Эти выравнивания совпадают частично, потому что BLASTn не выравнивает концы, но в тоже время довольно высокие проценты в связи с значимостью тРНК в процессах в клетках.