Vibrio cholerae – грамотрицательная, факультативно анаэробная, неинвазивная, патогенная бактерия, вызывающая заболевание желудочно-кишечного тракта – холеру, которая приводит к эпидемиям.

Холера известна с древних времен, первый случай был описан в XVI веке, в XIX веке заболевание распространилось по всему миру, сейчас наиболее часто вспышки возникают в Африке. В истории известны 7 эпидемий холеры [1, 2].

V. cholerae – свободноживущий, плавающий организм (обитает в муссонном климате), широко распространена в прибрежных водах и морепродуктах, при проглатывании которых и происходит заражение. Проходя через желудок, бактерия попадает в тонкий кишечник, на эпителии которого начинают формироваться колонии. Бактерии выделяют в межклеточное пространство холерный токсин – белковый комплекс, который нарушает ионный транспорт эпителиальных клеток, что приводит к потере воды и ионов, а, значит, к диарее, рвоте, мышечным спазмам. В некоторых случаях потеря жидкости может привести к летальному исходу в течение суток [1].

Стандартные данные о геноме раздел 3.1 были получены из файла assembly_stats для сборки с сайта NCBI (1).

Исследование содержания нуклеотидов по репликонам и кодирующим последовательностям раздел 3.2 проводился средствами языка программирования Python в Google Colab (6). В ходе скрипта происходит скачивание и обработка файлов с полными последовательностями для репликонов и файла с записями кодирующих последовательностей с сайта NCBI, после данные из файлов принимает на вход функция average_bases(), которая выдает в качестве результата содержание нуклеотидов. Критерий хи-квадрат был подсчитан с помощью библиотеки scipy.

Типы генов раздел 3.3, а также длины и количества белков раздел 3.7 были подсчитаны в Google Sheets (3, 5) с использованием функции COUNTIFS на основе таблицы локальных особенностей (feature_table.txt) с сайта NCBI (2). Подсчет различных тРНК раздел 3.4 был произведен с помощью фильтров над таблицей локальных особенностей (feature_table) в Google Sheets (3).

Распределение генов по "+" и "-" цепям для репликонов раздел 3.5 было подсчитано средствами Python 3 в Google Colab (6). В ходе скрипта обрабатывается файл с записями кодирующих последовательностей, если в комментарии к записи встречается слово "complement", то скрипт засчитывает эту последовательность, как последовательность на "-" цепи, в обратном случае - как последовательность на "+" цепи. t-тест был проведен с помощью библиотеки scipy.

Старт-кодоны кодирующих последовательностей раздел 3.6 были подсчитаны в Google Sheets (4) с использованием функции VLOOKUP, перед этим они были отобраны средствами командной строки bash.

Хромосома 1 содержит большую часть генов, отвечающих за рост и жизнеспособность. На хромосоме 2 также присутствуют метаболистические гены. Более подробное сравнение двух хромосом приводится в последующих результатах.

Плазмида в исследовании практически не затрагивается в связи с нехваткой данных для какого-либо ее анализа.

GC-состав чуть ниже 50%, что свидетельствует о мезофильности бактерии. С одной стороны, генетический материал должен быть легко подвержен изменениям для адаптации к внешней среде при свободном образе жизни, с другой стороны, должен быть достаточно устойчив, чтобы не разрушаться во внутриорганизменной среде.

Для обеих хромосом выполняются все правила Чаргаффа: количество аденина примерно равно количеству тимина, а количество цитозина – количеству гуанина; количество пуринов равно количеству пиримидинов (A + G = T + C); количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с кетогруппами в положении 6 (A + C = T + G).

Для оценки случайности распределения нуклеотидов можно использовать критерий хи-квадрат, который рассчитывается по формуле:

где O_i – наблюдаемое значение, E_i – ожидаемое значение. За ожидаемые значения примем значения нуклеотидного распределения исходя из GC-состава репликонов: для хромосомы 1: %A = %T = 26.25, %C = %G = 23.75; для хромосомы 2: %A = %T = 26.5, %C = %G = 23.5. Тогда значения хи-квадрат равны 0.0017 и 0.0004 для первой и второй хромосом соответственно, а p-value практически равно 1 для обеих хромосом. Таким образом, наблюдаемые данные очень хорошо соответствуют ожидаемым и полностью подтверждают нулевую гипотезу.

На хромосоме 2 достаточно много псевдогенов – генов, похожих на функциональные, но потерявших способность кодировать белок или РНК. Псевдогены возникают в результате мутаций и эволюционных процессов.

Плазмида содержит только белок-кодирующие гены, но большая часть этих белков – гипотетические, т.е. их структура и функции не установлены экспериментально.

Исходя из распределения генов можно предположить, что изначально две хромосомы были одинаковы, а в ходе эволюции важные гены "перетекали" со второй хромосомы на первую в целях более эффективной репликации и реализации генетической информации на одной хромосоме вместо двух. Вторая хромосома не редуцировалась полностью, так как все еще содержит важные функциональные гены.

Другая теория заключается в том, что вторая хромосома обеспечивает эволюционный резерв для жизни в разных экологических нишах.

Некоторые источники свидетельствуют о наличии горизонтального переноса генов, так как на первой и второй хромосоме присутствуют гены одинаковых белков, но филогенетика показывает, что они имеют разное происхождение [3].

В таблице 5 отображено распределение тРНК по аминокислотам. Для некоторых аминокислот имеются разные тРНК с одинаковыми антикодонами. Скорее всего, в геноме неоднократно происходили дупликации участков, кодирующих тРНК.

Наибольшее количество белков (442) имеет длину 150-200 аминокислотных остатков. Самый большой белок имеет длину 4545 аминокислотных остатков, этот белок функционально связан с токсином RtxA.

Поскольку гистограмма отображает все возможные белки V. cholerae, её можно назвать отображением популяции. Были вычислены её параметры: среднее значение равно 325, медианное значение равно 277. Среднее значение значительно отличается от медианного, можно сделать вывод, что распределение не является нормальным (подтверждается формой графика, он имеет вид гамма-распределения). Больше половины белков имеют длину менее 300 а.о., также имеются белки очень большой длины (>2000 а.о.), за счет которых среднее значение увеличено относительно медианного.

С помощью гистограммы можно посчитать вероятность встретить белки определенной длины. Таким образом, вероятность встретить белок длиной менее 100 а.о. равна 9.8%, более 1000 а.о. – 1.5%, от 100 до 300 а.о. – 45%.