Поиск сигналов. Теория

Задание 1.

Первая часть работы выполнялась Аксеновой Мариной

В первом задании требовалось, используя fuzznuc из пакета EMBOSS , найти все сайты, пересекающиеся с предсказанными сайтами транскрипционных факторов. Далее приведем описание программы fuzznuc и укажем опции, использовавшиеся при запуске. Были проверены 2 предсказанных мотива:

Функция	Описание	Алгоритм
Поиск шаблонов в нуклеотидных последовательностях	Ищет специфичный PROSITE-style паттерн в нуклеотидных последовательностях. Такие паттерны являются характеристиками длиной последовательности (как правило, короткая). Они могут задать поиск точной последовательности или они могут допустить различные вариации, совпадения с варьирующей длиной последовательности и повторяющимися блоками в последовательности. Одна и более нуклеотидных последовательностей читаются с файла. Выходной файл - стандартный файл отчета EMBOSS, включающий такие данные, как расположение и скор (вес) всех совпадений.	fuzznuc разумно выбирает оптимальный алгоритм поиска

LsrR

*Далее сравнение проводилось при условиях, что на вход программы fuzznuc подавался геном бактерии, т.е. сайты метилирования искались в нем. 1.05.2017: видимо, так как, поиск fuzznuc ведется в upstream regions и указываются относительные координаты, в итоге мы можем соотносить координаты из выдачи FIMO (смотрим 1-4 находки) и выдачу fuzznuc - так мы далее будем оценивать пересечение сайтов метилтрасфераз и транскрипционного фактора. На вход программе fuzznuc подавался файл MT.pat, содержащий сайты связывания метилтрасфераз только нашей бактерии (для чистоты эксперимента), команда:

fuzznuc -sequence mot -pattern @MT-sites.pat -outfile fuzznucMOT.out

По 4 последовательностям я проверила паттерны, результаты можно увидеть в таблице 2.

Таблица 2. Найденные программой fuzznuc сайты метилирования в участках генома Salmonella typhimurium LT2

Название гена/локуса	Координаты мотива относительно гена	Координаты взятого участка	Длина взятого участка	Число найденных совпадений	Файл с мотивом	Файл с результатом
ydeW/STM4073	177..207	4283447..4283477	31	25	mot4	fuzznuc4.out
ego/STM4074	11..41	4283281..4283311	31	29	mot1	fuzznucMOT2.out

Поскольку выдача fuzznuc по умолчанию ставит цепь "+", попробуем обратные цепи заменить на комплементарные с помощью Biopython: my_dna.complement()

Результат оказался аналогичен: скорее всего, метилазы (ну или fuzznuc) предпочитают положительные цепи.
Таблица 3. Комплементарные цепи, аналогично табл.2

Название гена/локуса	Координаты мотива относительно гена	Координаты взятого участка	Длина взятого участка	Число найденных совпадений	Файл с мотивом	Файл с результатом
ydeW/STM4073	215..235	4283281..4283311	31	25	mot2	fuzznucMOT2.out
ydeW/STM4073	49..79	4283447..4283477	31	20	mot3	fuzznucMOT3.out

Таким образом, казалось бы, в таких коротких последовательностях не могло бы быть слишком много сайтов метилирования метилтрансферазами, однако как показывают результаты - регуляция транскрипции метилированием действительно очень распространена, во всяком случае у данного вида бактерий: всего сайтов, пересекающихся с сайтами (4) посадки транскрипционного фактор - целых 99.

Однако, как ни странно, поиск только лишь по сайтам нашей бактерии (скачаны с REBASE) ни к чему не привел. Поэтому было решено запустить с сайтами, выставленными на кодомо.

Для того, чтобы проверить, насколько сайты метилирования совпадают с сайтами связывания транскрипционного фактора, мы разбили задачу на несколько этапов:

1)ответить на вопрос, сколько сайтов совпадает по координатам, сколько сайтов перекрывается

2)ответить на вопрос, значимо ли отклоняются старты и концы двух типов сайтов метилирования

3)ответить на вопрос, можно ли утверждать, что концы и старты сайтов метилирования ниже

Для ответа на 2 и 3 вопросы был написан скрипт на R, на вход ему подавались координаты из выдачи FIMO.

Были проведены тесты Уилкокса - ответы на вопросы 3 и 2 соответственно:

	Wilcoxon rank sum test with continuity correction

data:  met and fimo
W = 31908, p-value = 1
alternative hypothesis: true location shift is less than 0

Здесь из р-value очевидно, что старт однозначно выше (однако картину слегка портят повторяющиеся значения).

	Wilcoxon rank sum test with continuity correction

data:  met and fimo
W = 31908, p-value = 4.396e-11
alternative hypothesis: true location shift is not equal to 0

То есть на уровне значимости 5% старт не отклоняется с вероятностью 4.396e-11 - отклоняется довольно сильно. Далее проделаем тоже самое для координат конца.

Wilcoxon rank sum test with continuity correction

data:  met and fimo
W = 31272, p-value = 1
alternative hypothesis: true location shift is less than 0

Конец однозначно выше (p-value 1), однако картину слегка портят повторяющиеся значения.

Wilcoxon rank sum test with continuity correction

data:  met and fimo
W = 31272, p-value = 7.126e-10
alternative hypothesis: true location shift is not equal to 0

То есть на уровне значимости 5% старт не отклоняется с вероятностью 7.126e-10 - отклоняется довольно сильно. Таким образом, старт и конец имеют довольно разные координаты. Говоря о пересечении данных - они есть, но не слишком часты - об этом косвенно свидетельствуют низкие значения p-value в тесте Уилкоксона с двусторонней альтернативой. Было замечено, что пересекаются сайты МТ и ТФ порой даже так, что сайты МТаз заходят друг на друга внутри ТФ, а за пределами upstream regions это происходит нечасто, что и логично, ибо лучший варинат регуляции активности - это регионы upstream, где еще нет смысловой последовательности самого гена.

У прокариот вообще метилирование не играет сильно большой роли в регуляции экспрессии генов (то есть, если сайт связывания ДНК-метилазы пересекается с промоторным или регуляторным участком, метилирование может оказывать влияние на связывание транскрипционных факторов [1]- в основном, метилирование используется для того, чтобы отличать "старую и новую" цепи ДНК. При транскрипции же здесь, возможно, вклад метилирования достаточно мал или нестабилен (может даже иногда происходит рекомбинация - так и регулируется). Таким образом, короткие сайты, например "GATC" скорее всего просто случайно совпали, а в базе данный сайт прописан как сайт метилирования в "вирусном иммунитете".

Задание 2.

ЗАДАЧА: Используя REBASE проверьте есть ли в вашем геноме или геномах других штаммов того же вида ДНК метилтрансферазы с той же специфичностью. Укажите их в протоколе.

Итак, по запросу "Salmonella typhimurium LT2" в качестве организма, мы получаем таблицу, в которой указываются: номер организма в базе, латинское название вида (штамма), оптимальная температура роста, источник. Перейдя по ссылке с видом, мы получаем 14 находок, 10 из которых имеют некоторые паттерны, которые мы и будем проверять в задании 1. Поскольку каждая метилтрансфераза имеет свой сайт метилирования (но иногда они частично совпадают), далее число нахадок - это число совпадающих метилтрансфераз у разных штаммов.

Теперь проверим разные штаммы Salmonella typhimurium на совпадение паттернов.