Анализ транскриптомов.

Часть 1.

Подготовка чтений и их анализ.

Команда	Функция
fastqc chr3.1.fastq	Информация о качества чтений.

Картинка FastQC "Per base quality":

Рисунок 1.

Число чтений	21211
Длина чтений	33-51

Данная реплика имеет довольно хорошее качество, так как все столбцы находятся в зеленой зоне, и она имеет нормальную длину чтений.

Часть 2-3.

Картирование чтений и анализ выравниваний.

Команда	Функция
hisat2-build chr3.fasta chr3	Индексация референсной последовательности.
hisat2 --no-softclip -x chr3 -U chr3.1.fastq -S chr312.sam	Построение выравнивания прочтений и референса в формате .sam.
samtools view chr312.sam -b -o chr312.bam	Перевод выравниваний чтений с референсом в бинарный формат .bam.
samtools sort chr312.bam -T chr3.txt -o chr312sort.bam	Сортировка выравниваний чтений с референсом по координате в референсе начала чтения.
samtools index chr312sort.bam	Индексирование отсортированного файла.

Из 21211 чтений выравнено на геном 21055 чтений, из них 127 прочтений выравнено >1 раза. Число невыравнененных чтений - 156.

Из команды Hisat2 было убрано "--no-spliced-alignment", так как эта опция запрещает выравнивание отдельных фрагментов транскриптов при картировании. В данном случае этого делать ненужно.

Часть 4-5.

Подсчет чтений и анализ результатов.

Команда	Функция
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i chr312.bam > chr312.bed	Создание файла в формате .bed из файла формата .bam c координатами каждого выравненного чтения. Содержится вся информация из аннотации для более удобного анализа.
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b chr312.bed -c > peres_chr312.bed	Получение пересечения полученных координат с разметкой генов в файле формата .bed.
sort -k 6 -r peres_chr312.bed > sort.bed	Получение отсортированного файла.

Почти все прочтения легли в границы кодирующего белок гена TFRC, и только три прочтения легли в границы гена RNU7-18P, кодирующего малую ядерную РНК.

Белок, кодируемый TFRC, является мембранным белком, необходимым для доставки железа от трасферрина в клетку.

Часть 6.

Дополнительные функции Bedtools.

Команда	Функция
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtofastq -i chr312.bam -fq chr312.fq	Создание файла с чтениями в формате fastq. из файла с выраниванием.
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools getfasta -fi chr3.fasta -bed chr312.bed > chr3124.fasta	Получение файла с нуклеотидной последовательностью (.fasta) для одного из покрытых нашими чтениями генов.
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools cluster -i chr312.bed > cluster.bed	Объединение чтений в кластеры. (Всего 46 кластеров)

[назад]