pr14 Учебный сайт Чистяковой Екатерины

Практикум 14

Задание 1

С помощью команды 

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR424/008/SRR4240358/SRR4240358.fastq.gz

был скачан архив с чтениями проекта по секвенированию бактерии Buchnera aphidicola str. Tuc7.

Далее с помощью команды:

cat /mnt/scratch/NGS/adapters/* > adapters.fasta

был создан файл со всеми адаптерами для Illumina.

Удаление возможных остатков адаптеров: 

TrimmomaticSE -phred33 SRR4240358.fastq.gz SRR4240358_trim1.fastq.gz ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7 -trimlog trimmomatic1.log

В результате 1,66% (174955 чтений) оказались остатками адаптеров, соответственно 98,34% (10368884 чтения) "выжило".

Удаление с правых концов чтений нуклеотиды с качеством ниже 20, и удаление чтений, длина которых меньше 32 нуклеотидов:

TrimmomaticSE -phred33 SRR4240358_trim1.fastq.gz SRR4240358_trim2.fastq.gz TRAILING:20 MINLEN:32 -trimlog trimmomatic2.log

В результате 22,69% (2352447 чтений) оказались неподходящими, соответственно 77,31% (8016437 чтений) "выжило".
Изнчальный размер gz файла составлял 470М, после первого триммирования - 463М, после второго - 341М (суммарная разница 129).

Задание 2

Запуск программы velveth для коротких и не парных чтений для подготовки k-меров длиной 31:

velveth velv 31 -short -fastq.gz SRR4240358_trim2.fastq.gz

Результат запуска: директория с тремя файлами : Log, Roadmaps, (сопроводительная информация) Sequences (целевой файл)

Задание 3

Сборка k-меров с помощью velvetg:

velvetg velv

В результате в директорию добавилось 5 файлов.
N50 = 8600

С помощью конвейера:

grep -e '>' contigs.fa | tr '_' ' ' | sort -k4,4 -t ' ' -n -r | head -n 4 | less

были найдены 3 самых длинных континга и их покрытие:
>NODE 56 length 19821 cov 29.475859
>NODE 34 length 18714 cov 29.922678
>NODE 40 length 16436 cov 30.793623

Для анализа аномальных покрытий были использованы команды:

grep -e '>' contigs.fa | tr '_' ' ' | sort -k6,6 -t ' ' -n -r | less

grep -e '>' contigs.fa | tr '_' ' ' | sort -k6,6 -t ' ' -n | less


Медиана: >NODE_102_length_1717_cov_29.333721

В результате было найдено 13 аномально больших покрытий, максимальное превышает медиану в 14 раз, минимальное из аномальных практически в 5 раз. При этом длина контигов с аномально большими покрытиями варьируется от 53 до 949.
Контигов с аномально малыми покрытиями также 12. Минимальное - 1,7, максимальное аномальное - 5,75. Длина контигов варьируется от 31 до 115, т.е. вряд ли они могут являться шумом.

Задание 4

Сравнение программой megablast самых длинных контигов с хромосомой Buchnera aphidicola.

Для контига 34 было построено 6 выравниваний:

Таблица 1

Участок Процент идентичности Число гэпов Вес выравнивания
9387-11586 1896/2220 (85%) 30/2220 (1%) 2278
15025-18744 2935/3781 (78%) 144/3781 (3%) 2163
6139-9309 2453/3228 (76%) 92/3228 (2%) 1583
1-2495 1982/2530 (78%) 60/2530 (2%) 1581
12176-14000 1508/1850 (82%) 49/1850 (2%) 1476
5505-5979 392/478 (82%) 9/478 (1%) 398

Рис.1. DotPlot 34 контига.

Из DotPlotа видно крупные делеции, и что контиг "ложится" на начало хромосомы.

Для континга 40 было построено 2 выравнивания:

Таблица 2

Участок Процент идентичности Число гэпов Вес выравнивания
3-6889 5344/6962 (77%) 206/6962 (2%) 3703
6916-11860 3864/5019 (77%) 164/5019(3%) 2719

Рис.2. DotPlot 40 контига.

Делеций не видно, контиг ложится ближе к концу. Также можно заметить, что последовательность контига обратна хромосоме.

Для контига 54 было построено 3 выравнивания:

Таблица 3

Участок Процент идентичности Число гэпов Вес выравнивания
5342-13787 6513/8614 (76%) 345/8614 (4%) 3949
15478-18851 3580/4396 (81%) 83/4396 (1%) 3520
948-5226 3257/4325 (75%) 156/4325 (3%) 1927

Рис.3. DotPlot 54 контига.

Контиг ложится ближе к концу хромосомы, чем 40 контиг. Видна 1 делеция.