Нуклеотидный blast.

Таблица 1. Параметры запуска blast

Таблица 2. Описание параметров худших находок разных алгоритмов

Выводы:

• megablast находит самые достоверные и наиболее близкие гомологи
• discontigious megablast хорошо работает в плане поиска гомологов, которые прежде уже дивергировали, и имеют как схожие, так и различающиеся участки
• blastn выдает наиболее широкий спектр последовательностей, которые могут, вообще-то, и не быть гомологами исходной или являться очень далекими гомологами

Задание 3

Мною были выбраны белки HSP7C_HUMAN, TERT_HUMAN, CISY_HUMAN. Их последовательности я скачала и объединила в единый файл формата [fasta].

Я создала локальную базу данных на основе генома Amoeboaphelidium protococarum, записанного в файле X5.fasta, следующим образом:

	makeblastdb -in X5.fasta -dbtype nucl

tblasn — это программа, которая ищет по нуклеотидному банку последовательностей те, что кодируют белки, подающиеся на вход. Ей я и воспользовалась:

	tblastn -query inprot.fasta -db X5.fasta -out blast.out -outfmt 7

Выдача алгоритма для трёх выбранных белков приведена на рисунках ниже.

Белок	Выдача tblastn
HSP7C_HUMAN
Белок HSP7C[1] — это белок теплового шока. Репрессор активации транскрипции. Шаперон. Является компонентом PRP19-CDC5L комплекса, который формирует внутренню часть сплайсосомы. Этот белок необходим для активации сплайсинга пре-мРНК. Может выполнять структурную функцию в сборке сплайсосомы, поскольку контактирует со всем остальными ее компонентами. Связывает бактериальные липополисахариды и опосредует ЛПС-идуцированную воспалительную реакцию. В результате работы tblastn мы получили 22 находки. Первая из них, scaffold-199, представляется достаточно качественной. E-value 0.0, процент покрытия 78.09%. Последний показатель может показаться не очень высоким, но посмотрев отдельно на выравнивание (для этого scaffold-199 нужно было извлечь из файла генома), можно понять, что несовпадения сконцентрированы в конце выравнивания, поэтому, как минимум, здесь можно говорить о гомологии доменов с сохранением функции.
TERT_HUMAN
Белок TERT_HUMAN[2] — это обратная транскриптаза теломеразы. Теломераза — рибонуклеопротеиновый фермент, необходимый для репликации концов хромосомы у большинства эукариот. Активен в прогениторных и раковых клетках, в отличие от обычных соматических, где практически не действует. Является участником процесса элонгации теломер, при этом действуя как обратная транскриптаза: добавляет простые повторные последовательности к концам хромосомы, копируя образец с РНК-компонента фермента. (Катализирует РНК-зависимое удлинение 3'-конца хромосомы с помощью 6-нуклеотидной последовательности 5'-TTAGGG-3'). Каталитический цикл включает связывание праймера, удлинение праймера и высвобождение праймера по достижению конца РНК-затравки или же перенос возникающего продукта с его последующим удлинением. Играет важную роль в процессах старения и предотвращения апоптоза. На выдаче имеем 3 находки. Лучшая из них — scaffold-17 с E-value 8e-23 и Query cover 26.58%. Посмотрим на выравнивание. Раскраска BLOSUM62 By Conservation. Выравнивание, конечно, не самого высокого качества, но всё же встречаются участки (100-134, 381-402 и другие), на которых прослеживается сохранение мотивов. В этом случае, думаю, ответ на вопрос о наличии гомологов будет условно положительный. Вполне вероятно, что отдельные домены белка, закодированного в каком-то из генов scaffold-17, сохранили схожую с TERT_HUMAN функцию.
CISY_HUMAN[3]
Белок CISY_HUMAN — это белок митохондриальной цитрат-синтазы. Итак, он принимает участие в метаболизме углеводов, а именно — в цикле трикарбоновых кислот на стадии получения изоцитрата из оксалоацетата. tblastn выдал 6 находок. Лучшая из них — scaffold-693 с E-value 2e-180 и Query cover 69.5%. Интересно отметить, что с ней по всем параметрам очень схожа третья по счёту находка scaffold-157, только у нее BitScore на единицу меньше, а E-value чуть выше и составляет 5e-180. Также внутри обоих скэффолдов было по две находки (соответственно, 2-ая и 4-ая). Находки из двух разных скэффолдов имели одинаковые по сути выравнивания с последовательностью CISY_HUMAN, а различались рамкой считывания при формальной трансляции нуклеотидной последовательности скэффолда в последовательность аминокислот. Выравнивания хорошего качества, поэтому, как мне кажется, здесь можно вполне утверждать наличие гомолога. Для отдельно взятого скэффолда (693-ий или 157-ой) первое выравнивание соответствует одной части белка, гомологичного CISY_HUMAN, а второе — другой. Причём эти части в последовательности CISY идут подряд, а в исследуемом геноме разнесены в разные области скэффолда.

Задание 4

Для выполнения задания я выбрала из генома Amoeboaphelidium protococarum скэффолд scaffold-693. Предварительно была получена информация о длинах контигов:

	infoseq X5.fasta -only -name -length

А затем извлечена последовательность подходящего по длине scaffold-693:

	seqret X5.fasta:scaffold-693 -out 693.fasta

По этой последовательности был запущен алгоритм megablast с ограничением на таксон Amoeboaphelidium protococarum. Результаты можно видеть на Рис. 5

Рис.5

Рис. 6. Выравнивания находок из выдачи blast

По координатам участков и аннотации последовательностей в находках можно понять, что за гены содержатся в scaffold-693. Один из найденых участков участвует в кодировании 28S-рРНК, а второй — является частью спейсерного участка, функция которого предположительно заключается в обеспечении выского уровня транскрипции в связанных генах.