Связывание лигандов. Карманы связывания. Индуцированное соответствие.

Задание 1. Изменения.

В данном задании для анализа были даны две структуры - свободная и связанная с лигандом. Связывание белка с лигандом часто сопровождается такими конформационными изменениями аминокиcлотных остатков, которые повышают совместимость и способствуют более прочному связыванию молекул. Если включить поочередно отображение поверхности двух структур, можно четко увидеть изменения локализации аминокислот и образующийся карман. На втором рисунке ниже аминокиcлотные остатки как бы стягиваются и уплотняются, объем полости связывания с лигандом уменьшается. На первом изображении можно также заметить движение вторичных структур, изображенных зеленым цветом (петель и спиралей), участвующих в процессе стягивания.

Рис.1. Свободная форма, красная.	Рис.2. Связанная форма, зеленая.

Изменения в свободной и связанной формах рядом с активным центром белка в основном вызваны движением петель. Именно за счет их движения меняется форма кармана, она становится более закрытой. Сильнее всего изменениям подвержена часть белка, которая покрашена в синий цвет, поэтому она выделена на изображении ниже. Я выбрала три примера конформационных изменений, произошедших с аминокислотными остатками в ходе связывания с лигандом.

Рис.3. Связанная и свободная форма белка; синие петли принадлежат связанной форме, окрашенной в бирюзовый цвет; красным цветом отмечена свободная форма.

На изображениях ниже видно, что петли, отмеченные синим цветом, очень сильно меняют свое положение относительно красных петель, принадлежащих свободной форме. Ближайшая к нам петля, которую хорошо видно на рисунке 4, за счет сдвига как бы закрывает щель для связывания. Этот сдвиг петель связан со смещением остатка фенилаланина, который на рисунке 4 покрашен в желтый цвет. В основном за счет изменения, связанного с Phe'186, происходит сближения этого остатка с остатком Asn'237, так как его положение в пространстве вместе с положением вторичной структуры, к которой он принадлежит, меняется не так значительно.

Рис.4. Изменение положения петель и Phe'186 в разных формах белка.	Рис.5. Изменение положения петель и остатков Asn'237.

При связывании лиганда и при движении петель образуется возможная водородная связь между остатком Phe'186 и остатком Asn'237. Происходит их сближение на расстояние, при котором эта связь возможна. Это вероятно вносит вклад в фиксирование положения петель в новой связанной форме. Изначально между аминокислотными остатками, расположенными внизу на изображениях, в свободной форме водородная связь образоваться не могла. После сближения и стягивания кармана связывания их конформация изменилась, они стали ближе к друг другу. Вероятнее всего в новой конформации водородная связь между ними возможна.

Рис.6. Phe'186, Asn'237 Свободная форма.	Рис.7. Phe'186, Asn'237 Связанная форма.

Еще одно изменение, связанное с самым значительным сдвигом петли, показано на изображениях ниже. Петля, которая укрывает активный центр при связывании лиганда, несет на себе остаток лизина 200. Следовательно, он меняет свое расположение и может после сдвига образовывать водородную связь с остатком Gln'320. При этом остаток Gln'320 особо не меняет свою конформацию. Такая связь может укреплять положение петли в пространстве и формировать более закрытый карман.

Рис. 8. Движение петли с остатком лизина.	Рис. 9. Lys'200Gln'320. Связанная форма.

На самой подвижной, рядом с активным центром, петле расположен еще один интересный, в плане изучения, остаток. Сдвиг петли также вызывает изменение положения Thr'202. Этот сдвиг показан на рисунке 8. В связанной форме этот остаток приобретает способность образовывать водородную связь с протонированным лигандом. Получается, это изменение при взаимодействии с лигандом также способно участвовать в формировании активного центра, придавая ему более закрытую форму.

Рис. 8. Движение петли с остатком треонина.	Рис. 9. Thr'202 и лиганд. Связанная форма.

С помощью сервера POCASA я смогла найти карманы, принадлежащие каждой из двух форм белка. В PyMol были отражены пять кластеров точек для каждой структуры. Номер остатка точки показывает ID кармана, который фигурирует в ранжировании на сайте. Ниже представлены изображения разных ракурсов кластеров с индивидуальной окраской. Номер соответствует ID кластера.

На первом изображении видны предсказанные карманы. Точки были изображены в таком формате, чтобы лучше отразить объем полостей. Возможно, из-за того что карман связывания лиганд слишком мал, программа не включила его в топ-5 кластеров точек. Карман 174 расположен снаружи от кармана связывания.

Рис. 12. Связанный белок с топ-5 карманами с использованием surface.

Два нижних изображения отличаются тем, что бирюзовый кластер из топ-5 карманов занял место связывания лиганда. Его объем равен 366. Синяя и розовая полость рисунка номер 11 - это новые карманы. Возможно, они образовались путем разъединения кластера 174 рисунка 10. Розовый и синий кластер рисунка номер 10 не попали в топ-5 кластеров связанной структуры.

Рис. 13. Связанный белок с топ-5 карманами.	Рис. 14. Свободный белок с топ-пять карманами.

Другой ракурс тех же структур показывает, что кластер 484 уменьшился по сравнению с кластером 335. Тоже самое случилось с кластером 179. Он уменьшился по сравнению с карманом 149 связанной структуры.

Рис. 15. Связанный белок с топ-5 карманами.	Рис. 16. Свободный белок с топ-5 карманами.

Я считаю, что программа довольно хорошо определила полости, которые присутствуют в моей молекуле. Так как по моим предположениям карман связывания лиганда отображен только в свободной структуре, его объем нельзя сравнить с карманом в связанной структуре. Наверное, здесь он слишком мало, и программа его не включила в топ-5 кластеров. В таком случае, произошло слишком сильное стягивание остатков при взаимодействии с лигандом молекулы. Я полагаю, что стягивание происходит во время связывания лиганда.

Задание 2. Протонирование, подготовка к докингу.

Первоначально я протонировала белок с помощью сайта PDB2PQR. Затем к лиганду были добавлены протоны вручную. Ниже представлены изображения структур до и после протонирования. Молекулы были сохранены для дальнейшего использования. Вопросов к новой структуре не возникло, водороды добавлены с соблюдением валентности атомов и под приемлемым углом.

Рис. 17. Лиганд.	Рис. 18. Протонированный лиганд.

Задание 3. Докинг.

В данном задании генерировались гипотезы расположения лиганда. Для этого использовалась программа Webina. Я загрузила протонированную структуру белка на сайт, параметры оставались по умолчанию. Добавила к вводным данным лиганд в протонированном виде в двух разных форматах. С помощью инструмента на сайте я задала карман связывания лиганда. После всех манипуляций я получила 9 предсказанных поз, положений в кармане лиганда.

Ниже представлены рисунки положения лиганда в выданной мне связанной структуре, он обозначен красным цветом. Желтым цветом обозначены лиганды, которые были предсказаны программой Webina. Также в структуре отмечен карман связывания с прилегающими к лиганду аминокислотными остатками. Можно сказать, что ни одна из 9 предсказанных структур не совпадает точно с первоначальным лигандом. Все они локализованы в одном месте и перекрываются. Некоторые позиции предсказаны совсем недостоверно. Они, как изображено на втором рисунке, практически перекрываются с аминокислотными остатками кармана. Такое положение не образуется в реальной структуре.

Рис. 19. Красным цветом отмечен лиганд из файла bound.pdb; желтым - предсказанные позиции (9).	Рис. 20. Цветом margenda отмечен остаток Ser'185; красным - оригинальный лиганд; желтым - предсказания.

Я выбрала позу, максимально похожую на первоначальное положение лиганда по расположению и ориентации в пространстве:

Рис. 21. Наилучшая предсказанная позиция лиганда.

Для истинной позы и лучшей позы из выдачи была построена визуализация с помощью PoseView. Для этого необходимо было загрузить белок и сохраненный лиганд. Взаимодействия представлены на рисунках:

Рис. 22. Связанная форма структуры во взаимодействии с первоначальным лигандом.	Рис. 23. Свободная форма структуры при взаимодействии с лучшей позой.

Две позы лиганда имеют довольно большое количество идентичных взаимодействий. Оба лиганда схоже взаимодействуют с образованием водородных связей, отмеченных пунктиром. В обоих случаях присутствуют аминокислоты: Asp'238, Asn'264, Asn'237, Glu'292, Glu'323. При этом, Asp'238 и Glu'292 имеют в разных вариантах форм по одной дополнительной предсказанной водородной связи. В связанной форме есть Lys'203 и Thr'202, которые присутствуют только здесь и вносят вклад в формирование водородных связей. Лизин добавляет одну водородную связь, а треонин две. Lys'203 расположен в петле, которая сильнее всего меняет свою конформацию в связанной форме, эту петлю я рассматривала в первом задании. Она как бы прикрывает активный центр при связывании с лигандом.

Так как многие взаимодействия схожи для двух лигнадов, очень вероятно, что эти аминокислоты могут служить первоначальными "якорями" в процессе связывания. Предсказанная структура расположена в кармане схоже с референсной. Все предсказанные структуры не сильно отличались друг от друга. Вероятно изменения и смещение аминокислотных остатков могли произойти уже после связывания. Эффекта индуцированного соответствия, в таком случае, здесь не наблюдается. Первоначальное мое предположение в задании один было неверным.

© Кирпиченко Алина, 2021