Выравнивание последовательностей

Глобальное парное выравнивание гомологичных белков

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	2156,0	61,3%	74,8%	14	2
Polyribonucleotide nucleotidyltdansferase	PNP_ECOLI	PNP_BACSU	1730,0	49,2%	66,4%	42	4
Phosphoglycerate kinase	PGK_ECOLI	PGK_BACSU	908,0	47,4%	66,7%	17	3

Локальное парное выравнивание гомологичных белков

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	2158,0	61,6%	74,9%	13	2	99,4%	99,3%
Polyribonucleotide nucleotidyltdansferase	PNP_ECOLI	PNP_BACSU	1736,0	51,7%	69,7%	10	3	96,1%	97,5%
Phosphoglycerate kinase	PGK_ECOLI	PGK_BACSU	908,0	48,1%	67,5%	14	2	97,7%	98,5%

Глобальное и локальное выравнивание негомологичных белков

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
Elongation factor G/L-threonine 3-dehydrogenase	EFG_ECOLI	TDH_BACSU	43,0	10,9%	18,2%	467	25

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Elongation factor G/L-threonine 3-dehydrogenase	EFG_ECOLI	TDH_BACSU	48,0	20,8%	36,1%	29	5	19,7%	34,6%

В таблицах 3 и 4 представлены результаты применения программ выравнивания к неродственным белкам: фактору элонгации G из Escherichia coli и L-треонин 3-дегидрогеназе Bacillus subtilis. Белки были намеренно выбраны так, чтобы между ними не было функциональной связи, которая могла бы быть ассоциирована с гомологией. Из результатов видно, что родство белков исключено: процент идентичности для полных последовательностей составляет всего 10,9%, а вес выравнивания - 43,0. С помощью программы water были найдены наиболее близкие по последовательности аминокислот участки полипептидных цепей, но даже для них процент идентичности составил всего 20,8%, а вес выравнивания - 48,0. При этом покрытие обоих последовательностей также очень мало по сравнению со значениями этий величины для выравниваний гомологичных белков: 19,7% и 34,5% - что также свидетельствует о том, что сходство белков, если оно и может быть обнаружено, возникло случайно, и данное выравнивание не имеет биологического смысла.

Множественное выравнивание белков и импорт в Jalview

Для составления множественного выравнивания была выбрана мнемоника EFG. По запросу mnemonic:efg_* AND reviewed:yes в Swiss-Prot можно найти 677 белков. Полное название белка из E.coli - Elongation factor G. Из полученного списка были выбраны, помимо EFG_ECOLI и EFG_BACSU, еще 5 идентификаторов белков: EFG_THETH, EFG_STAAU, EFG_MYCTU, EFG_STAAN, EFG_SHIFL. Для подготовки данных для выравнивания использовались функции командной строки: seqret и muscle. Был создан файл efg.txt со списком идентификаторов белков, с помощью которого впоследствии был получен файл в fasta-формате командой seqret @efg.txt efg.fasta. Далее командой muscle -in efg.fasta -out efg_alignment.fasta был получен файл с выравнянными последовательностями в формате fasta. Далее с помощью программы Jalview была создана визуализация полученного выравнивания: множественное выравнивание в Jalview. Изучая полученное выравнивание, можно отметить, что наиболее близки между собой белки EFG_ECOLI, EFG_SHIFL и EFG_THETH, EFG_BACSU, EFG_STAAU, EFG_STAAN, при этом наиболее часто отличается от общей картины последовательность аминокислот белка EFG_MYCTU. Можно предположить, что в эволюционном пути он отстоит от остальных в выборке. В целом можно утверждать, что все данные белки гомологичны, так как имеется достаточно много участков с высокой долей совпадения для всех белков выборки. В частности, присутствуют достаточно длинные участки, на которых все 7 последовательностей идентичны: 20-34, 88-99, а на участках 53-72, 273-280, 465-473 отклонения возникают только для EFG_THETH.

Параметры программ needle и water

Protein Name	ID 1	ID 2	Gap opening penalty	Extend penalty	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	20	2,0	2091,0	61,1%	74,8%	14	2
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	20	0,1	2106,2	61,1%	74,3%	14	2
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	10	0,5	2156,0	61,3%	74,8%	14	2
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	1	5,0	2271,0	59,9%	73,3%	86	6
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	1	0,1	2359,2	58,1%	69,4%	164	43

Protein Name	ID 1	ID 2	Gap opening penalty	Extend penalty	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	20	2,0	2096,0	61,6%	74,9%	13	2	99,4%	99,3%
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	20	0,1	2111,2	61,6%	74,9%	13	2	99,4%	99,3%
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	10	0,5	2158,0	61,6%	74,9%	13	2	99,4%	99,3%
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	1	5,0	2317,0	60,0%	72,7%	100	17	100,0%	100,0%
Elongation factor G	EFG_ECOLI	EFG_BACSU	1	0,1	2359,2	58,1%	69,4%	164	42	100,0%	100,0%

При запуске needle и water без опции -auto программа требует от пользователя ввести вручную значения Gap opening penalty (штраф за открытие гэпа) - количество единиц, вычитаемых из веса выравнивания на каждый первый гэп - и Extend penalty (штраф за удлинение) - количество единиц, вычитаемых из веса выравнивания за каждый последующий гэп в индели. По умолчанию эти значения равны соответственно 10,0 и 0,5. В таблицах 5 и 6 приведены результаты запуска команд needle и water с различными значениями вышеописанных параметров. В целом стоит отметить, что значения процента идентичности и схожести при изменении штрафов остаются практически неизменными, уменьшаются по мере уменьшения штрафов на незначительную величину. Закономерно с ростом штрафов уменьшается вес выравнивания и наоборот.

Задача программы состоит в том, чтобы при заданных значениях штрафов построить выравнивание с наибольшим весом, поэтому при увеличении штрафа за открытие гэпа их число должно максимально уменьшаться, однако с учетом того, что штраф за гэп обычно выше штрафа за "замену" аминокислоты количество гэпов и инделей уже при значении gap opening penalty по умолчанию является наименьшим возможным и при увеличении его не меняется. При уменьшении штрафа за открытие гэпа их количество растет, что видно из таблиц для обеих команд: при значении gap opening penalty = 10.0 число гэпов составляет 13-14, а пр значении = 1 - до 164. Значение параметра extend penalty влияет на то, распределены гэпы в выравнивании преимущественно поодиночке или объединены в индели по несколько. Чем ниже штраф за удлинение гэпа, тем больше инделей наблюдается в полученном выравнивании. При этом число гэпов также растет, вероятно, вслествие того, что выравнивание с очень большим количеством одиночных гэпов имело бы меньший вес из-за малого числа совпадений аминокислотных остатков. Например, при одном и том же значении штрафа за открытие гэпа = 1 при величине штрафа за его удлинение = 5 в глобальном выравнивании наблюдается 86 гэпов и всего 6 инделей, а при величине = 0.1 - 164 гэпа и 43 индели. Среди особенностей локального выравнивания можно отметить, что при уменьшении штрафов за открытие и удлинение гэпа покрытие последовательности выравниванием достигает 100% для обоих белков.