Ресеквенирование. Поиск полиморфизмов у человека.

Для работы мне были предоставлены файлы chr14.fastq и chr14.fasta.

Все действия выполнялись в специально созданной директории /nfs/srv/databases/ngs/lady_mari

Анализ качества чтений

Программа FastQC позволяет проводить быстрый и несложный контроль качества "сырых" данных секвенирования. Она проводит набор стандартных статистических анализов, которые можно использовать для предварительной оценки релевантности данных и выявления возможных проблем в полученной последовательности.

Использованная команда: fastqc chr14.fastq

В результате был получен архив chr14_fastqc.zip, содержащий отчет о работе программы в виде html файла - chr14_fastqc.html

В целом качество чтений можно назвать уловлетворительным, однако для повышения качества лучше провести чистку.

Очистка чтений

Очистка чтений была проведена с помощью программы Trimmomatic. Адаптеры в исследуемой последовательности были уже удалены. Необходимо было отсечь с конца чтения нуклеотиды с неудовлетворительным качеством (< 20), для этого был указан параметр TRAILING:20. Также требовалось оставить только прочтения длины не менее 50, поэтому был указан параметр MINLEN:50.

Использованная команда:

java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr14.fastq chr_trim.fastq TRAILING:20 MINLEN:50

Выходной файл:chr_trim.fastq

"Очищенная" последовательность была проанализирована с помощью FastQC.

Использованная команда:

fastqc chr_trim.fastq

Выходной файл:chr_trim_fastqc.html

до очистки

после очистки

После очистки число ридов уменьшилось на 134 (с 8696 до 8562), были у ридов были удалены участки, где качество нуклеотидов ниже 20, а так же были удалены участки, длина которых меньше 50

Картирование чтений.

  1. Добавление пакета программ в path

Использованная команда:

PATH=${PATH}:/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5

  1. Индексирование референсной последовательности

Использованная команда:

hisat2-build chr14.fasta chr14

Выход: Несколько файлов в формате ht2.

  1. Создание выравнивания референсной последовательности и прочтений

Использованная команда:

hisat2 -x chr14 -U chr_trim.fastq --no-spliced-alignment --no-softclip > 1_align.sam

Выходной файл: 1_align.sam

Анализ выравнивания

  1. Перевод выравнивания в бинарный формат

Использованная команда: samtools view 1_align.sam -bo 1_align.bam

Выход: 1_align.bam

  1. Сортировка бинарного выравнивания

Использованная команда: samtools view 1_align.sam -bo 1_align.bam

Выходной файл: 1_align.bam

  1. Сортировка бинарного выравнивания

Использованная команда: samtools sort 1_align.bam -T file.txt -o alignsort.bam

Выходной файл: alignsort.bam

  1. Выяснение числа чтений, откартированных на геном

Использованная команда: samtools idxstats alignsort.bam > reads.out

Выходной файл: reads.out

Из файла reads.out, я получила информацию, что на хромосому откартировалось 8546 чтения и 21 чтения откартированы не были.

Поиск SNP и инделей

  1. Создание файла с полиморфизмами в формате .bcf

Использованная команда: samtools mpileup -uf chr11.fasta chr11_sort.bam -o snp.bcf

Выход: snp.bcf

  1. Создание файла со списком отличий между референсом и чтениями в формате .vcf

Использованная команда: bcftools call -cv snp.bcf -o snp.vcf

Выходной файл: snp.vcf

    Было обнаружено 87 однонуклеотидных полиморфизмов и 3 инделя. Три избранных вариации охарактеризованы в таблице.

    Примеры полиморфизмов
Координата	Тип	В референсе	В прочтении	Качество прочтения на участке	Глубина покрытия на участке
21024619        замена       A                G         221.999                         37
21025604        вставка      tg               tGg       4.4191                          1
21026773        замена       C                T         225.009                         42

    Аннотация SNP

      Далее необходимо было аннотировать полученные SNP с помощью программы ANNOVAR. Для этого сначала нужно было подготовить входной файл, чтобы программа моглас ним работать. В первую очередь из файла snp.vcf были удалены все индели, полученный файл - snp_noindel.vcf. Затем был использован скрипт convert2annovar.pl.

    1. Подготовка входного файла

    Использованная команда: perl /nfs/srv1/databases/annovar/convert2annovar.pl.old -format vcf4 /nfs/srv/databases/ngs/lady_mari/snp1.vcf > /nfs/srv/databases/ngs/lady_mari/snp1.avinput

    Выход:snp1.avinput

    Полученный файл использовался для аннотации SNP по базам данных refgene, dbsnp, 1000 genomes, GWAS и Clinvar c помощью скрипта annotate_variation.pl. В Annovar существуют 3 типа аннотаций по базам данных, основанных на: генной разметке (gene-based annotation); разметке других регионов генома (region-based annotation); фильтрации (filter-based annotation). Тип использованной аннотации указан для каждой базы данных отдельно.

    Refgene

    Тип аннотации: gene-based annotation.

    Использованная команда: /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -out rs.refgene -build hg19 snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

    Полученнные файлы: 1. rs.refgene.variant_function - содержит описание всех полиморфизмов
    2. rs.refgene.exonic_variant_function - содержит описание полиморфизмов внутри экзонов.
    3. rs.refgene.log - содержит отчет о работе команды
    База данных refseq в annovar делит snp на несколько категорий, которые отображены в первой колонке файла chr11.refgene.variant_function. Они указывают, где находится данный полиморфизм - внутри экзона, интрона, гена некодирующей РНК и т.п. 

    Возможные категории:
exonic - полиморфизм внутри экзона (частично или полностью)
splicing - полиморфизм в пределах 2 bp от границы сплайсинга (число bp можно изменить)
ncRNA - полиморфизм полностью или частично входит в транскрипт, не имеющий аннотации как кодирующий
UTR5 - полиморфизм полностью или частично входит в 5-нетранслируемую область
UTR3 - полиморфизм полностью или частично входит в 3-нетранслируемую область
intronic - полиморфизм полностью или частично внутри интрона
downstream - полиморфизм в пределах 1-kb downstream от сайта окончания транскрипции (параметр может быть изменен)
upstream - полиморфизм в пределах 1-kb upstream от сайта начала транскрипции (параметр может быть изменен)
intergenic - полиморфизм на пересечении генов

Распределение SNP по группам в моем файле: 
exonic	intronic	UTR3	Всего
3	82		1	86
    Если полиморфизм попадает в категории exonic/intronic/ncRNA, то во второй колонке того же файла указывается имя соответсвующего гена (если это сразу несколько генов, то они разделяются запятой). Если полиморфизм попадат в какую-либо другую категорию, то во второй колонке будут указаны два соседних гена и расстояние между ними. В моем случае в категории, для которых указывается ген, попали 85 полиморфизмов. Все они расположены на одном из трех генов - PPP2R5C, TSHR, RNASE9.
    Большинство аннотированных полиморфизмов (95%) принадлежат категории intronic, и лишь 3 (3%) - категории exonic. Это можно считать достаточно логичным, так как замены в некодирующих последовательностях не подвергаются такому тщательному отбору, как замены в последовательностях, кодирующих белки. Полиморфизмы категории exonic могут приводить к аминокислотным заменам и, в случае несинонимичных замен, к нарушению функии белка. В таблице более подробно рассмотрены полиморфизмы, попавшие внутрь экзонов, с указанием нуклеотидных и аминокислотных замен: 
    №	Координаты (*)	Ген	Н. замена	Тип замены	Качество чтений	    Глубина покрытия	А.к. замена
1       21024619	RNASE9	A>G		гомозиготная    221.999	            37                  S204P, S209P
2	81562998	TSHR	T>C	        гомозиготная    222.791	            18                  N187N
3       102391577	PPP2R5C	G>C		гомозиготная    221.999	            23                  A546P, A476P, A515P, A531P

    Dbsnp

    Тип аннотации: filter-based annotation

    Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.snp -build hg19 -dbtype snp138 snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

    Полученнные файлы: 1.rs.snp.hg19_snp138_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в dbsnp, то есть аннотированные в этой базе данных.
    2.rs.snp.hg19_snp138_filtered- содержит отфильтрованные полиморфизмы (не имеющие rs в dbsnp).
    3. rs.dbsnp.log - содержит отчет о работе команды.
    Аннотация по базе dbsnp показала, что 81 полиморфизмов имеют rs, а 6 не имеют.

    1000 genomes

    Тип аннотации: filter-based annotation

    Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.snp -build hg19 -dbtype snp138 snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

    Полученнные файлы: 1. rs.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_dropped - содержит полиморфизмы, имеющие rs в 1000 genomes, и их частоты.
    2. rs.1000g.hg19_ALL.sites.2014_10_filtered -содержит полиморфизмы, не имеющие rs в 1000 genomes.
    3.rs.1000.log - содержит отчет о работе команды.
    Аннотация по 1000 genomes привела к схожему результату. 79 snp по-прежнему имеют rs, а 8 не имеют, ситуация с качеством и глубиной прочтения та же. Дополнительно мы смогли узнать частоты аннотированных полиморфизмов. Они варьируют от 0,00599042 до 0,921925. Средний показатель - 0,255754918.

    Gwas

    Тип аннотации: region-based annotation

    Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

    Полученнные файлы: 1.rs.gwas.hg19_gwasCatalog_dropped - содержит snp, имеющие известное клиническое значение.
    Файл оказался пустым, т.е. из аннотация не дала никаких результатов.
    2.rs.gwas.hg19_gwasCatalog_filtered- содержит полиморфизмы, не имеющие rs в Gwas.
    3.rs.gwas.log - содержит отчет о работе команды

    Gwas

    Тип аннотации: region-based annotation

    Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

    Полученнные файлы: 1.rs.gwas.hg19_gwasCatalog_dropped - содержит snp, имеющие известное клиническое значение.
    Файл оказался пустым, т.е. из аннотация не дала никаких результатов.
    2.rs.gwas.hg19_gwasCatalog_filtered- содержит полиморфизмы, не имеющие rs в Gwas.
    3.rs.gwas.log - содержит отчет о работе команды

    Clinvar

    Тип аннотации: filter-based annotation

    Использованная команда: perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl.old -filter -out rs.clinvar -build hg19 -dbtype clinvar_20150629 snp1.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

    Полученнные файлы: 1.rs.clinvar.hg19_clinvar_20150629_dropped - содержит snp, имеющие известное клиническое значение.
    Файл оказался пустым, т.е. из аннотация не дала никаких результатов.
    2.rs.clinvar.hg19_clinvar_20150629_filtered- содержит полиморфизмы, не имеющие rs в Clinvar.
    3.rs.clinvar.log - содержит отчет о работе команды

    Сводная таблица SNP

    Сводную таблицу Excel можно скачать по ссылка.

    Использовались только файлы с анноированными snp (dropped).