Практикум №9: Выравнивание последовательностей

1. Программа подсчёта инделей

Написана программа на Python ~/term2/indels/indels.py, которая анализирует файл выравнивания и считает количество инделей (непрерывных блоков гэпов) в каждой последовательности.

2. Глобальное выравнивание (needle)

Как найти эти данные?

Score, % Identity, % Similarity и Gaps взяты из выходных файлов needle. Indels посчитаны программой indels.py.

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
Chaperonin GroEL	CH60_ECOLI	CH60_BACSU	1694.5	61.5%	77.3%	8	5
Chaperone protein DnaK	DNAK_ECOLI	DNAK_BACSU	1767.0	55.4%	72.9%	33	5
RNA polymerase subunit beta	RPOB_ECOLI	RPOB_BACSU	3034.0	42.5%	55.5%	433	17

3. Локальное выравнивание (water)

Как найти эти данные?

Score, % Identity, % Similarity и Gaps взяты из выходных файлов water. Indels посчитаны программой indels.py. Coverage рассчитано как (длина фрагмента)/(полная длина белка)×100%.

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Chaperonin GroEL	CH60_ECOLI	CH60_BACSU	1695.5	61.7%	77.6%	7	4	99.6%	99.8%
Chaperone protein DnaK	DNAK_ECOLI	DNAK_BACSU	1767.0	55.8%	73.3%	30	4	99.7%	99.2%
RNA polymerase subunit beta	RPOB_ECOLI	RPOB_BACSU	3039.0	43.7%	57.0%	396	14	99.5%	96.5%

4. Комментарии к выравниваниям

GroEL (CH60_ECOLI / CH60_BACSU)

Гомологичны ли белки по всей длине? Да. Процент идентичности в глобальном выравнивании 61.5%, в локальном 61.7% — значительно выше порога гомологии (20–25%). Покрытие локального выравнивания составляет 99.6% для CH60_ECOLI и 99.8% для CH60_BACSU, то есть практически вся длина обоих белков вовлечена в выравнивание. Разница в длине (548 и 544 а.о.) объясняется небольшими вставками/делециями.

Информативно ли локальное выравнивание? В данном случае локальное выравнивание даёт почти те же результаты, что и глобальное: процент идентичности чуть выше (61.7% против 61.5%), гэпов и инделей чуть меньше. Это ожидаемо, поскольку белки гомологичны по всей длине и локальное выравнивание почти не отбрасывает участков.

Различия между выравниваниями: существенных различий нет. В локальном выравнивании не сопоставлены лишь самые концы (первые 2 а.о. у ECOLI и первый а.о. у BACSU), потому что они не дают положительного вклада в вес.

DnaK (DNAK_ECOLI / DNAK_BACSU)

Гомологичны ли белки по всей длине? Да. Процент идентичности 55.4% (needle) и 55.8% (water) — выше порога гомологии. Покрытие локального выравнивания 99.7% для DNAK_ECOLI и 99.2% для DNAK_BACSU. Разница в длине (638 и 611 а.о.) объясняется вставками/делециями.

Информативно ли локальное выравнивание? Локальное выравнивание даёт близкие результаты: чуть выше идентичность (55.8% против 55.4%), меньше гэпов (30 против 33) и инделей (4 против 5). Это связано с тем, что локальное выравнивание не включает в себя небольшой негомологичный участок на C-конце BACSU.

Различия между выравниваниями: основные различия — на C-концевом участке. У DNAK_BACSU есть дополнительный фрагмент, который в глобальном выравнивании сопоставляется с гэпами, а в локальном вообще не участвует. Покрытие BACSU 99.2% показывает, что около 5 а.о. на C-конце остались за пределами локального выравнивания.

РНК-полимераза β (RPOB_ECOLI / RPOB_BACSU)

Гомологичны ли белки по всей длине? Белки гомологичны, но не по всей длине: RPOB_ECOLI имеет 1342 а.о., RPOB_BACSU — 1193 а.о. Разница почти 150 а.о. В глобальном выравнивании это отражается большим числом гэпов (433) и низкой идентичностью (42.5%). Покрытие локального выравнивания: 99.5% для ECOLI и 96.5% для BACSU — у BACSU около 40 а.о. (примерно с 1161 по 1193) остаются за пределами выравнивания.

Есть ли гомологичные участки? Да, локальное выравнивание нашло участок с идентичностью 43.7%, что выше порога гомологии. Он охватывает почти всю длину обоих белков, кроме C-концевого фрагмента BACSU.

Информативно ли локальное выравнивание? Да, здесь локальное выравнивание более информативно: оно повышает процент идентичности (43.7% против 42.5%) и уменьшает число гэпов (396 против 433). Это происходит потому, что глобальное выравнивание вынуждено сопоставлять негомологичные C-концевые участки, порождая лишние гэпы.

Различия между выравниваниями: в глобальном выравнивании многие участки выровнены с большим числом гэпов — особенно на C-конце, где у BACSU нет продолжения. В локальном выравнивании эти участки просто не включены, что и даёт более высокий процент идентичности.

5. Неродственные белки

Взяты белки с разными функциями: EFTS_ECOL6 (фактор элонгации Ts) и DNAK_BACSU (шаперон DnaK).

Как найти эти данные?

Данные взяты из выходных файлов needle и water, индели посчитаны программой indels.py.

Выравнивание	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Глобальное (needle)	48.5	10.8%	16.7%	384	16	—	—
Локальное (water)	56.5	25.9%	36.2%	61	10	55.1%	21.4%

Вывод: белки EFTS_ECOL6 (фактор элонгации Ts) и DNAK_BACSU (шаперон DnaK) являются неродственными. Процент идентичности в глобальном выравнивании — всего 10.8% при 384 гэпах, что значительно ниже порога гомологии (20–25%).

Локальное выравнивание нашло участок длиной 174 колонки с идентичностью 25.9% и 61 гэпом. Однако этот участок покрывает лишь 55.1% длины EFTS_ECOL6 и 21.4% длины DNAK_BACSU. Такой небольшой фрагмент (156 а.о. у EFTS_ECOL6, 131 а.о. у DNAK_BACSU) при идентичности чуть выше порога может быть результатом случайного совпадения. Большое число гэпов в обоих выравниваниях подтверждает отсутствие эволюционной связи между белками.

6. Множественное выравнивание

Мнемоника: CH60 (шаперонин GroEL)

Полное имя белка из E. coli: Chaperonin GroEL

Количество найденных белков в Swiss-Prot: 791 (по запросу id:CH60_* AND reviewed:true)

Выбранные 5 белков (помимо CH60_ECOLI и CH60_BACSU):

CH60_HUMAN (человек)
CH60_MOUSE (мышь)
CH60_RAT (крыса)
CH60_CHICK (курица)
CH60_ENTAG (бактерия Pantoea)

Выравнивание выполнено: в Jalview через Web Service → Alignment → ClustalO → with Defaults.

Проект Jalview: Скачать проект Jalview

Комментарии к выравниванию:

В выравнивании семь последовательностей CH60: CH60_ECOLI, CH60_BACSU, CH60_HUMAN, CH60_MOUSE, CH60_RAT, CH60_CHICK, CH60_ENTAG. Все семь белков — гомологи, поскольку являются шаперонинами GroEL. Это подтверждается тем, что они хорошо выравниваются по всей длине и имеют высокую идентичность.

Структура выравнивания. Видны чередующиеся консервативные и вариабельные участки:

Колонки ~20–60: высококонсервативный N-концевой участок.
Колонки ~110–200: чередование консервативных блоков и вариабельных вставок.
Колонки ~200–400: наиболее консервативная часть выравнивания.

N-концевой сигнал у эукариот. У эукариотических последовательностей (CH60_HUMAN, CH60_MOUSE, CH60_RAT, CH60_CHICK) в начале выравнивания (колонки 1–20) есть дополнительный участок, которого нет у бактериальных (CH60_ECOLI, CH60_BACSU, CH60_ENTAG). У бактерий в этих колонках стоят гэпы. Этот участок соответствует митохондриальному сигнальному пептиду, поскольку GroEL у эукариот локализуется в митохондриях. В Swiss-Prot у этих белков стоит пометка «Precursor».

Вывод: все семь белков гомологичны и хорошо выравниваются. Наибольшая консервативность — в средней части (колонки ~200–400). Наименее консервативны N-конец (за счёт митохондриального сигнала у эукариот) и отдельные позиции на C-конце.

← Назад к списку работ