Отчёт по практической работе №14

Задача: провести сборку генома de novo по данным секвенирования бактерии Buchnera aphidicola str. Tuc7.

Для выполнения поставленной задачи были выбраны короткие одноконцевые прочтения, полученные с помощью технологии Illumina. Код доступа чтений в базе данных ENA: SRR4240356. Общее число чтений: 7511529.

Данные чтения содержат последовательности адаптеров. Чтобы избавиться от них, все известные последовательности адаптеров были записаны в файл adapters.fa. Затем была применена программа Trimmomatic для одноконцевых чтений:

TrimmomaticSE SRR4240356.fastq.gz SRR4240356_trim.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7

В результате выполнения данной операции было удалено 153091 прочтений (2.04% от всех чтений).

Затем нужно было очистить последовательности от позиций плохого качества и удалить слишком короткие прочтения. Для этого была использована следующая команда:

TrimmomaticSE SRR4240356_trim.fastq SRR4240356_trimf.fastq TRAILING:20 MINLEN:32

То есть с правых концов чтений были удалены нуклеотиды с качеством меньше 20, а также были удалены чтения, короче 32 нуклеотидов. В результате было удалено 305092 (4.15%) чтений. Если до 'чистки' плохих чтений файл с ними весил 0.72 Гб, то после неё - 0.69 Гб. Полученные послеедовательности чтений уже можно использовать для сборки генома.

Для сборки генома была выбрана программа velvet, осуществляющая алгоритм, использующий граф де Брёйна. Поэтому первым делом следует подготовить k-меры. Это было сделано с помощью следующей команды:

velveth Assem 31 -fastq -short SRR4240356_trimf.fastq

Применённые опции:

-fastq &mdash формат файла с чтениями;

-short &mdash были использованы короткие одноконцевые чтения;

Assem &mdash название директории с результатами выполнения команды;

31 &mdash k-меры какой длины нужно получить.

После того, как данная команда была выполнена и k-меры были подготовлены, можно запускать сам алгоритм сборки:

velvetg Assem

В результате была создана сборка, состоящая из 82 контигов и имеющая N50 равный 65554 при общей длине сборки 659837, что является неплохим показателем. Было определено три самых длинных контига:

>NODE_8_length_111962_cov_38.660198

>NODE_6_length_107488_cov_34.174030

>NODE_10_length_80939_cov_37.524174

После тэга 'length' указана длина контига, после 'cov' - покрытие (можно понимать как то, среднее значение того, сколько раз встретился каждый k-мер из контига в чтениях). Таким образом, самые длинные контиги имеют длины 111962, 107488 и 80939 (при чём это длина, указанная 'в контигах', т.е. их длины в нуклеотидах на 30 больше).

Была рассчитана медиана покрытий контигов. Она равна 16.64. Собственно, аномально высокое значение покрытия (>83,2) имеют следующие 8 контигов:

>NODE_27_length_282_cov_458.429077

>NODE_17_length_950_cov_447.494751

>NODE_14_length_934_cov_444.608124

>NODE_29_length_308_cov_436.269470

>NODE_2_length_524_cov_419.526703

>NODE_20_length_501_cov_309.155701

>NODE_55_length_42_cov_211.428574

>NODE_36_length_45_cov_166.199997

Такие контиги могут быть связаны с повторами в геноме. Аномально низкое же покрытие (<3.3) имеют 2 контига:

>NODE_74_length_31_cov_3.064516

>NODE_123_length_91_cov_2.362637

Взглянув на них, можно заметить, что они действительно отличаются от остальных, например, в них практически отсутствуют повторы T. Такие контиги не несут практически никакой полезной информации, могут быть связаны с засорением пробы и т.д.

Все полученные контиги можно посмотреть здесь.

Сравним 3 самых длинных контига с референсным геномом Buchnera aphidicola (штамм Sg) (код доступа Refseq: GCF_000007365.1). Для этого были проведены выравнивания соответствующих последовательностей с помощью megablast.

Контиг 10: выравнялся на обратную цепь хромосомы на координатах 124592 - 198923 (см. рис.1, таблица 1).

Таблица 1. Характеристики выравниваний контига 10 на хромосому Buchnera aphidicola str. Sg
№ % identity alignment length mismatches gap opens q. start q. end s. start s. end
1 79.574 11456 2102 192 22381 33728 176511 165186
2 78.960 9957 1823 217 73 9899 198923 189109
3 79.186 8259 1529 148 44003 52168 155000 146839
4 76.304 9626 1947 258 55035 64475 143634 134158
5 83.522 3708 550 44 33915 37593 164960 161285
6 82.980 3208 497 37 64594 67784 134086 130911
7 75.529 4867 1005 147 69297 74059 129376 124592
8 84.906 1378 177 24 67916 69275 130830 129466
9 79.380 1644 288 46 14864 16478 184028 182407
10 78.030 1188 244 17 53176 54353 145787 144607

Контиг 6: выравнялся на прямую цепь хромосомы на координатах 224649 - 329761 (см. рис.2, таблица 2).

Таблица 2. Характеристики выравниваний контига 6 на хромосому Buchnera aphidicola str. Sg
№ % identity alignment length mismatches gap opens q. start q. end s. start s. end
1 83.468 5450 731 133 51319 56687 275325 280685
2 78.073 7443 1447 139 77558 84912 300247 307592
3 76.223 8399 1826 147 16322 24649 240921 249219
4 79.908 5460 991 84 102 5506 224649 230057
5 77.382 6424 1216 179 57455 63770 281375 287669
6 78.549 5184 974 104 45990 51108 270046 275156
7 80.170 4241 732 92 28384 32565 252821 257011
8 78.069 4432 853 87 91727 96076 314359 318753
9 77.210 4660 954 85 11648 16251 236289 240896
10 78.229 3964 770 82 39827 43745 264126 268041
11 82.851 2525 400 23 8978 11491 233479 235981
12 83.645 2299 356 18 24681 26969 249302 251590
13 77.841 3493 667 85 67433 70870 290753 294193
14 82.632 2234 370 18 96696 98919 319264 321489
15 75.288 4257 914 115 103039 107231 325579 329761
16 78.009 2592 472 75 71691 74232 294987 297530
17 81.729 1828 292 30 5693 7500 230176 231981
18 76.698 2635 519 79 86913 89509 309620 312197
19 81.965 1547 264 14 75706 77242 298415 299956
20 80.143 1395 257 20 65795 67179 289161 290545
21 79.644 1125 221 8 63986 65105 287911 289032
22 84.628 592 81 5 74265 74848 297640 298229
23 77.904 792 155 17 33553 34335 258005 258785

Контиг 8: самый длинный из полученных. Выравнялся на прямую цепь хромосомы на координатах 458393 - 567722 (см. рис.3, таблица 3)

Таблица 3 Характеристики выравниваний контига 8 на хромосому Buchnera aphidicola str. Sg
№ % identity alignment length mismatches gap opens q. start q. end s. start s. end
1 81.778 16134 2643 218 87410 103366 545069 561082
2 79.468 12395 2254 225 14620 26908 472743 484952
3 87.689 5808 524 123 81581 87300 539282 544986
4 82.278 6557 1015 109 103595 110099 561261 567722
5 82.452 4519 717 48 63097 67589 521171 525639
6 78.234 5729 1090 117 75762 81418 533534 539177
7 79.337 4975 932 78 70506 75431 528532 533459
8 78.512 4435 863 75 5068 9461 463184 467569
9 77.526 4761 943 98 32 4732 458393 463086
10 78.420 4203 805 76 47478 51658 505626 509748
11 79.554 3546 580 102 57949 61400 515883 519377
12 73.441 6913 1485 282 36247 43004 494400 501116
13 75.730 4660 975 121 27011 31602 485189 489760
14 79.089 2415 447 49 9515 11901 467567 469951
15 79.275 2316 434 28 33857 36133 491916 494224
16 75.583 3432 694 112 54522 57893 512526 515873
17 81.909 1697 264 32 45773 47445 503857 505534
18 80.331 1088 195 15 51767 52845 509809 510886
Рис. 1 Карта локального сходства контига 10 и хромосомы Buchnera aphidicola str. Sg
Рис. 2 Карта локального сходства контига 6 и хромосомы Buchnera aphidicola str. Sg
Рис. 3 Карта локального сходства контига 8 и хромосомы Buchnera aphidicola str. Sg

Как видим, все контиги выравниваются на хромосому B. aphidicola str. Sg довольно продолжительными участками. То есть есть длинные очень похожие между двумя последовательностями участки, а между ними - участки, между которыми megablast не находит соответствий (что объясняется тем, что megablast ищет последовательности, почти идентичные заданной). При этом нигде не наблюдается инверсий, делеций или инсерций, что ожидаемо, ведь мы сравниваем последовательности геномов двух организмов одного вида.