Практикум 10. Выравнивание последовательностей белка

Глобальное парное выравнивание гомологичных белков

Для выравнивания использовались белки с одинаковой мнемоникой, присутствующие одновременно в протеоме кишечной и сенной палочек. Выравнивание производилось с помощью программы "needle" из пакета EMBOSS. Результаты выравнивания представлены в таблице 1.

Таблица 1. Глобальное выравнивание трех пар белков
Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
ATP-dependent DNA helicase DinG	DING_ECOLI	DING_BACSU	513.5	19.3%	31.6%	393	25
HTH-type transcriptional repressor PurR	PURR_ECOLI	PURR_BACSU	40.5	15.3%	32.2%	120	13
Putative xanthine dehydrogenase molybdenum-binding subunit XdhA	XDHA_ECOLI	XDHA_BACSU	34.0	5.5%	9.8%	696	14

Любопытно, что несмотря на гомологию белков, выравнивание показало низкий процент идентичности (<20%). Стоит отметить немалое количество пропусков во всех выравниваниях, особенно в последнем, где число "гэпов" равно 696, а процент идентичности рекордно низок (5.5%).

Локальное парное выравнивание гомологичных белков

Для получения более точных результатов было проведено локальное выравнивание тех же пар белков, с использованием программы "water" из пакета EMBOSS.

Таблица 2. Локальное выравнивание трех пар белков
Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
ATP-dependent DNA helicase DinG	DING_ECOLI	DING_BACSU	523.0	25.4%	41.3%	155	22	97.3%	74.5%
HTH-type transcriptional repressor PurR	PURR_ECOLI	PURR_BACSU	52.0	17.5%	35.4%	90	13	82.4%	86.0%
Putative xanthine dehydrogenase molybdenum-binding subunit XdhA	XDHA_ECOLI	XDHA_BACSU	43.5	19.0%	30.4%	51	5	14.5%	47.3%

В результате степень идентичности возросла (максимум до 25.4%), но все равно осталась маленькой для гомологичных белков. У первых двух пар количество пропусков уменьшилось примерно вдовое, в то время как у белков с мнемоникой "XDHA" этот показатель упал почти в 7 раз (с 696 до 51). Доля покрытия белка в первых двух случаях оказалась в среднем около 75-98%, в последнем - доля белков из пары весьма неравнозначна. Так, у кишечной палочки процент покрытия белка выравниванием составляет 14.5%, а у сенной - 47.3%.

Результаты третьей пары могут быть обусловлены небольшим количеством белков с такой мнемоникой и недостаточной их изученностью. Всего по запросу "mnemonic:xdha*" в базе данных Uniprot появились 3 записи, 2 из которых относятся к рассматриваемым бактериям, а последний - к другому штамму кишечной палочки (Escherichia coli O157:H7). На странице записи1 в описании указано, что классфикация фермента не была точно установлена, до сих пор неизвестно, относится ли он к дегидрогеназам или же к оксидазам. Все это дает основания предполагать, что несмотря на рецензию и положение в Swiss-Prot белки с мнемоникой "XDHA" недостаточно изучены.

Результат применения программ выравнивания к неродственным белкам

Для сравнения с гомологичными белками также были проведены аналогичные выравнивания случайной пары белков с разной мнемоникой. Результаты находятся в таблице 3 и таблице 4 ниже.

Таблица 3. Глобальное выравнивание белков с разной мнемоникой
Protein Name 1	Protein Name 2	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
tRNA-specific adenosine deaminase	Phosphomethylpyrimidine synthase	TADA_ECOLI	THIC_BACSU	34.0	5.3%	8.9%	527	10

Таблица 4. Локальное выравнивание белков с разной мнемоникой
Protein Name 1	Protein Name 2	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
tRNA-specific adenosine deaminase	Phosphomethylpyrimidine synthase	TADA_ECOLI	THIC_BACSU	42.0	32.0%	64.0%	0	0	15.0%	4.2%

Глобальное выравнивание показало самый низкий процент идентичности (5.3%) и второй по величине показатель "гэпов", тем самым демонстрируя различия белков. Поскольку выравнивание производится формально, такие показатели можно считать на уровне погрешности.

В то же время локальное выравнивание показало хоть и до сих пор небольшие показатели схожести (32% идентичности), но для всех пар они являются рекордными (за исключением покрытия, оно достигает минимума в 4.2%). Более того, у этого выравнивания не обнаружено ни одного пропуска, а следовательно, нет и инделей. Вероятно, такое совпадение можно назвать случайным, потому что белки едва ли похожи друг на друга по функции (EC:3.5.4.33 и EC:4.1.99.17).

Множественное выравнивание белков и импорт в Jalview

Всего для мнемоники "PurR" найдено 96 белков (запрос "mnemonic:purr*"), из которых 3 записи устарели, поэтому в итоге остается 93. Для выравнивания преимущественно использовались белки из известных организмов. Их коды доступа: P0ACP7, P37551, O68446, Q9KRC1, Q7CIS2, P46456 и B4EWM9. По данным страницы Uniprot2 белок из кишечной палочки с такой мнемоникой носит имя "HTH-type transcriptional repressor PurR".

Выравнивание проводилось при помощи программы "muscle" из пакета EMBOSS при стандартных настройках. Команду и файл можно просмотреть ниже.

muscle -in purr.fasta -out purr_alignment.fasta

Просмотреть fasta файл выравнивания

Обработка производилась в программе Jalview, последовательности были отсортированы по парному выравниванию (pairwise alignment) и покрашены по шаблону "% Identity". Результаты можно просмотреть в виде проекта, изображения с аннотацией или филогенетического дерева.

мульти-выравнивание белков с мнемоникой PurR — Рис 1. Мульти-выравнивание белков с мнемоникой PurR

Рис 2. Дерево родства белков с мнемоникой PurR

Уже по изображениям можно сделать вывод о больших расхождениях последовательности белка сенной палочки с другими белками. В остальном последовательности похожи между собой: дополнительное вычисление парных выравниваний показывает процент идентичности между остальными последовательностями не менее 50%. Поэтому имеется множество участков с выраженной структурой (например, столбцы с 131 по 142 включительно консервативны и одинаковы у всех 6 белков). В то же время процент идентичности с белком сенной палочки не превосходит 20%, что хотя и примерно соответствует результатам работы needle между потенциально гомологичными белками, но дает основание предполагать, что белок, возможно, не гомологичен остальным.

Сравнение белка Q9K4U1 с его гомологом P12758

Помимо уже упомянутых организмов - кишечной и сенной палочек, было проведено выравнивание с участием белка из холерного вибриона, его код доступа - Q9K4U13. Для более точного построения выравнивания с его гомологом P127584 использовалась программа water с опцией '-auto'.

Результаты представлены в таблице 5. Они в высокой степепени соответстуют гомологичным белкам - все показатели, кроме 1 инделя и гэпа являются максимальными для всех проведенных сравнений. Кроме того, длина покрытия стремится к 100%, а значит такое выравнивание почти повторяет глобальное, и проведение анализа с помощью needle даст те же самые результаты.

Таблица 5. Локальное выравнивание белка Q9K4U1 с его гомологом P12758
Protein Name 1	Protein Name 2	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Uridine phosphorylase	Uridine phosphorylase	Q9K4U1_VIBCL	UDP_ECOLI	1008.0	75.1%	90.1%	1	1	99.6%	100.0%

Сравнение входных параметров needle и water

Эти параметры охватывают штрафы за открытие и продолжение гэпов. По-умолчанию для программы needle они составдяют 10.0 за первый и 0.5 за каждый последующий гэпы в инделе. (результат скачивания curl происходит из-за расположения белка Q9K4U1 в TrEMBL)

 needle uniprot:Q9K4U1 sw:P12758
Needleman-Wunsch global alignment of two sequences
  % Total    % Received % Xferd  Average Speed   Time    Time     Time  Current
                                 Dload  Upload   Total   Spent    Left  Speed
100 17581    0 17581    0     0   1644      0 --:--:--  0:00:10 --:--:-- 31394
Gap opening penalty [10.0]:
Gap extension penalty [0.5]:

Эти параметры по-умолчанию имеют те же самые значения и у water.

water uniprot:Q9K4U1 sw:P12758
Smith-Waterman local alignment of sequences
  % Total    % Received % Xferd  Average Speed   Time    Time     Time  Current
                                 Dload  Upload   Total   Spent    Left  Speed
100 17581  100 17581    0     0   1718      0  0:00:10  0:00:10 --:--:-- 95032
Gap opening penalty [10.0]:
Gap extension penalty [0.5]:

В качестве свидетельства влияния этих параметров на поиск выравнивания, например, можно отменить афинные штрафы за гэп у одного из уже проведенных (локального, между белками с мнемоникой XDHA).

water sw:xdha_ecoli sw:xdha_bacsu
Smith-Waterman local alignment of sequences
Gap opening penalty [10.0]: 10
Gap extension penalty [0.5]: 10

Теперь оптимальное выравнивание изменилось, все гэпы исчезли, покрытие уменьшилось, однако проценты идентичности и схожести возросли. Результаты отображены в таблице 6.

Таблица 6. Локальное выравнивание белков без афинных штрафов за гэп
Protein Name 1	Protein Name 2	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Putative xanthine dehydrogenase molybdenum-binding subunit XdhA	Putative xanthine dehydrogenase molybdenum-binding subunit XdhA	XDHA_ECOLI	XDHA_BACSU	29.0	21.1%	34.2%	0	0	5.1%	11.5%