Практикум 11

Задание 1

Команда	Функция
fastqc chr10.fastq	Выдает информацию о качестве прочтений chr10.fastq
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chr10.fastq trim_chr10.fastq TRAILING:20 MINLEN:50	Выдает файл trim_chr10.fastq, где отрезаны с концов прочтений нуклеотиды качеством менее 20 и удалены чтения длиной меньше 50
fastqc trim_chr10.fastq	Выдает информацию о качестве прочтений trim_chr10.fastq

Рис. 1 Качество прочтения ридов до очистки

Рис. 2 Качество прочтения после очистки

До очистки файл содержал 10666 прочтений
После очистки файл содержал 10526 прочтений

Убрав нуклеотиды, качество прочтения которых меньше 20, среднее качество естественным образом выросло.
Кроме того, уменьшился и доверительный интервал, который теперь почти полностью лежит в зелёной зоне.
Также были удалены очень короткие риды, которые больше подвержены загрязнениям и имеют малую информативность.

Задание 2

Команда	Функция
hisat2-build chr10.fasta his_chr10	Выдаёт индексированную референсную последовательность в формате fasta
hisat2 -x his_chr10 -U trimm_chr10.fastq --no-spliced-alignment --no-softclip > align.sam	Выравнивает прочтения с референсной последовательностью
samtools view align.sam -b -o align.bam	переводит файл из формата sam в формат bam
samtools sort align.bam -T file.txt -o alignsort.bam	Сортирует выравнивание чтений
samtools idxstats alignsort.bam > resut.txt	записывает число закартированных чтений

В результате было откартировано 10395 чтений. 131 чтение не откартировалось

Задание 3

Поиск SNP и инделей

Команда	Функция
samtools mpileup -uf chr10.fasta sort.bam > snp.bcf	Создаёт файл с полиморфизмами
bcftools call -cv snp.bcf -o snp.vcf	Создаёт файл описания различий рефересной последовательности и данных прочтений

Было найдено 66 полиморфизмов. Представлнные ниже мутации являются достоверными, так
как подтверждаются солидным числом прочтений, и качество прочтений также неплохое.

Координата	Тип мутации	Нуклеотид референса	Нуклеотид чтений	Глубина прочтения	Качество прочтения
5781628	Замена	T	G	21	117.008
5781969	Замена	A	T	18	225.009
5784151	Замена	A	G	83	225.009

Аннотация SNP

Подготовка данных к аннотации была проведена следующей командой:

perl /nfs/srv/databases/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 snp.vcf -o chr10.avinput

Далее был проведён поиск SNP в 5 базах данных:

База данных	Команда
Refgene	perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -out chr10_refg -build hg19 chr10.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/
dbsnp	perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -dbtype snp138 -out chr10.snp -build hg19 chr10.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/
1000 genomes	perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -dbtype 1000g2014oct_all -out chr10_1000g -buildver hg19 chr10.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/
GWAS	perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -regionanno -dbtype gwasCatalog -out chr10_gwas -buildver hg19 chr10.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/
Clinvar	perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl -filter -dbtype clinvar_20150629 -out chr10_clinvar -buildver hg19 chr10.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/

Из 66 найденных полиморфизмов 9 не имеют описания. Результаты поиска по базам описаны в таблице
В базе Clinvar не было найдено ни одного snp, что означает отсутствие доказанно вредоносных мутаций.

Refgene

45 замен оказались в интронах, в экзонах 10, в UTR3 - 2.

dbsnp

Было найдено 57 аннотированных snp. Ещё 9 не были определены.

1000 genomes

Частота мутаций была посчитана для 54 snp. Минимальная частота - 0.000798722, максимальная - 0.997604, средняя - 0.61, медиана - 0.72.

GWAS

Было найдено 3 замены, ассоциированные с различными болезнями (остеосаркома, ревматоидный артрит, витилиго).

Clinvar

В базе Clinvar не было найдено ни одного snp, что означает отсутствие доказанно вредоносных мутаций.