сравнительный анализ канонической днк и стеблей трнк
1. построение структур a-, b- и z-днк
были сгенерированы модели a-, b- и z-форм днк, состоящие из пятикратного повтора нуклеотидной последовательности gatc. построение выполнялось с помощью программы fiber из пакета 3dna на сервере kodomo.fbb.msu.ru с использованием опций -a, -b и -z для a-, b- и z-форм соответственно.
полученные структуры:
gatc-a.pdb gatc-b.pdb gatc-z.pdb2. сравнение идеализированной и экспериментальной a-днк
для оценки отличий между идеализированной и реальной a-днк была проведена сравнительная визуализация модели gatc-a.pdb, построенной fiber, и экспериментальной структуры a-днк с pdb id 3v9d. обе структуры были загружены в pymol и представлены в виде «cartoon» с различной окраской цепей.
на рисунках хорошо видно, что идеализированная a-днк имеет более ровный сахарофосфатный остов и практически регулярные витки спирали. экспериментальная структура 3v9d заметно короче по оси спирали и слегка изогнута; отдельные витки различаются по длине и форме, а ширина большой и малой бороздок немного варьирует по виткам. эти различия отражают влияние кристалл-упаковки, ионной среды и локальных деформаций реальной молекулы, отсутствующих в идеализированной модели fiber.
3. большая и малая бороздки днк (пример на цитозине)
для анализа геометрии бороздок на примере a-днк в pymol была выделена пара оснований, содержащая цитозин, и показаны атомы основания с подписями. структуру поворачивали таким образом, чтобы две цепи днк были видны по сторонам, а между ними отчётливо просматривались широкая и узкая щели - большая и малая бороздки соответственно.
в выбранном цитозине было проанализировано направление отдельных атомов относительно бороздок. было установлено, что в сторону малой бороздки обращены атомы c2, o2 и n1, тогда как в сторону большой бороздки направлены атомы c4, c5, c6 и n4. таким образом, доноры и акцепторы на o2, n1 и c2 формируют характерный паттерн малой бороздки, а атомы c4, c5, c6 и n4 участвуют во взаимодействиях со стороны большой бороздки.
4. геометрические параметры a-, b- и z-форм днк
шаг спирали и число оснований на виток для каждой из форм определялись по положению атомов фосфора одной цепи при рассмотрении структуры "с торца", согласно подсказкам к заданию. молекулу поворачивали так, чтобы ось спирали была направлена вдоль луча зрения, затем измеряли расстояние между атомами p, принадлежащими соседним виткам, и подсчитывали число нуклеотидов в одном витке.
ширина большой и малой бороздок оценивалась как минимальное расстояние между атомом фосфора выбранного нуклеотида одной цепи и атомами фосфора другой цепи; для каждой формы были выбраны репрезентативные пары нуклеотидов в регулярной части спирали. полученные значения сведены в таблицу 1.
| форма | тип спирали | шаг спирали, å | число оснований на виток | ширина большой бороздки, å | ширина малой бороздки, å |
|---|---|---|---|---|---|
| a-форма | правая | 28 | 11 | 16.8 (a/g5 - b/a38) | 8.0 (a/a10 - b/g25) |
| b-форма | правая | 33 | 10 | 17.2 (a/t11 - b/t27) | 11.7 (a/t15 - b/a30) |
| z-форма | левая | 43.5 | 12 | 23.5 (a/c8 - b/c28) | 8.7 (a/g7 - b/g39) |
5. анализ структуры трнк (1f7u) с помощью 3dna
в качестве примера рнк-структуры была рассмотрена трнк^arg из комплекса argrs-трнк^arg с pdb id 1f7u. исходный файл 1f7u.pdb был при необходимости приведён к старому формату при помощи программы remediator, а затем проанализирован программами find_pair и analyze из пакета 3dna.
команда find_pair -t 1f7uold.pdb 1f7u.fp позволила определить спаренные основания и расположение спиралей, а команда analyze 1f7u.fp сгенерировала набор текстовых файлов с подробными параметрами структуры, включая файл 1f7u.out с описанием всех пар оснований, торсионных углов и водородных связей.
6. стебли трнк 1f7u
по результатам анализа find_pair и с учётом нумерации нуклеотидов трнк от 1 до 76 в молекуле выделяются четыре стебля:
- акцепторный стебель: нуклеотиды 1-7 и 72-66
- d-стебель: нуклеотиды 10-13 и 25-22
- антикодоновый стебель: нуклеотиды 39-44 и 31-26
- tψc-стебель: нуклеотиды 49-53 и 65-61
эти участки соответствуют четырём основным плечам классической клеверной вторичной структуры трнк и формируют основу l-образной третичной структуры молекулы.
7. неканонические пары оснований в трнк
по отчёту 1f7u.out и данным задания в трнк 1f7u обнаружено девять неканонических пар оснований:
- psu901 - a972
- u905 - g968 (u-g wobble-пара)
- 5mu954 - 1ma958 (оба основания модифицированы)
- psu955 - g917
- a943 - psu927
- a944 - m2g926
- c913 - c922
- a914 - u908
- a915 - u948
здесь psu обозначает псевдоуридин, 5mu - модифицированный тимидин (5-метилуридин), а 1ma и m2g - метилированные производные аденина и гуанина. эти пары не относят к стандартным watson-crick a-u и g-c: часть из них имеет геометрию wobble (например, u-g), часть представляет собой c-c-пары или контакты между модифицированными основаниями с изменённым набором донорных и акцепторных групп. неканонические пары локально изгибают двойную спираль и участвуют в формировании специфических мотивов третичной структуры трнк.
8. дополнительные водородные связи и стабилизация третичной структуры
из файла 1f7u.out были выделены строки, описывающие дополнительные водородные контакты, помимо основных пар в стеблях:
- 954_:[5mu]t-**--a[1ma]:.958
- 955_:[psu]p-**+-g[..g]:.917
- 914_:[..a]a-**--u[..u]:.908
- 915_:[..a]a-**+-u[..u]:.948
- 918_:[..g]g-----c[..c]:.956
эти записи соответствуют дополнительным взаимодействиям между парами 5mu954-1ma958, psu955-g917, a914-u908, a915-u948 и g918-c956. символы -**-- и -**+- указывают на наличие дополнительных донорно-акцепторных контактов и особую ориентацию оснований по сравнению с классическими парами.
указанные дополнительные водородные связи соединяют удалённые участки трнк, связывая, например, элементы tψc-петли с d-петлёй и другими стеблями, тем самым стабилизируя l-образную третичную структуру. наличие модифицированных нуклеотидов в этих парах (5mu, psu, 1ma, m2g) обеспечивает дополнительные доноры и акцепторы водородных связей, повышая жёсткость и специфичность контактов между стеблями.