Cписок полезных материалов:
Прямая последовательность в формате ab1
Обратная комплементарная последовательность в формате ab1
Прямая последовательность в формате ab1 после очистки
Обратная комплементарная последовательность в формате ab1 после очистки
Плохая хроматограмма в формате ab1
Сайт с полезной информацие о интерпретации данных в Chromas
Проект Jalview с выравниванием
Отредактированная прямая последовательность в fasta
Отредактированная обратная комплементарная последовательность в fasta
1) В данном практикуме были проанализированы результаты секвенирования - хроматограммы.
Это будет проводиться с помощью инструмента Chromas.
Инструмент Chromas был скачен по ссылке ниже:
Сайт и дистрибутивом ChromasФайлы, с которыми проводилась работа, можно скачать по ссылкам вверху.
Были идентифицированы нечитаемые участки - это концевые участки с большим количеством непрочтенных нуклеотидов - N.
Координаты нечитаемых участков - для прямой цепи: 0-23 и 675-720, для обратной цепи: 0-20.
Нечитаемые участки были удалены из-за большого процента шума и наличия большого количесва N (непрочитанных нуклеотидов).
2) Выровнены на глаз последовательности в Chromas:
Рис. 1 Фрагмент выравнивания последовательности
3) Оценка качества хроматограмм
Характеристика прямой цепи:
Шум в 10 раз меньше чем сигнал. Средняя сила сигнала и шума равномерна в центре хроматограммы вдоль оси Х (в читаемых участках). Самые высокие пики у гуанина. Характеристическая особенность-двойные пики.
Характеристика обратной цепи:
Шум меньше сигнала на 85%. Самые высокие пики от гуанина и аденина. Средняя сила сигнала неравномерна, средняя сила шума равномерна вдоль оси Х. Присутствуют размытые пики, обусловленные низкой селективностью хроматографа. Последовательности были выровнены друг относительно друга, и была создана "чистая" последовательность.
4) Редактирование последовательности:
Здесь и далее - подпись снизу картинки
Сверху исходная последовательность, снизу обратная комплементарная.
Проблему из себя представляют размытые пики. На данном месте я поставила T поскольку только он давал сигнал(пик был только от тимина). На вставке изображение тех же пиков в увеличенном виде.
Рис. 2
Проблему из себя представляеяет слабый сигнал. На данной позиции я поставила аденин, поскольку он стоит в обратной комплементарной цепочке.
Рис. 3
Два пика перекрываются. На данной позиции я поставила T, посмотрев на обратную комплементарную цепочку.
Рис. 4
Сдвоенный пик. На данной позиции я поставила T, поскольку он стоит в обратной комплементарной цепочке.
Рис. 5
В данной позиции на хроматограмме отчетливо видны пики.
Рис. 6
5) Полученные последовательности выровнены с помощью muscle в Jalview
Выравнивание в формате fasta
Рис 7 Фрагмент выравнивания, реализованного с помощью muscle
Вверху представлена прямая последовательность, внизу - комплементарная, маленькими буквами- измененные нуклеотиды.
Можно заметить, что процент полных совпадений очень высок.
6) Плохая хроматограмма
Рис. 7
На данной хроматограмме можно видеть размытые пики, большое количество шума(высота шумовых пиков составляет 40% от высоты пиков сигнала).
Спасибо! :)